W biologii molekularnej dobrym wyborem buforu i przygotowaniem do różnych etapów izolacji DNA może być różnica między przejściem do ekspresji białka a otwarciem kolejnego zestawu maxi-prep na początek nad. Pomimo ich kluczowego znaczenia, przepisy na bufory są często właśnie takie – przepisy napisane bez wyjaśnienia lub uzasadnienia dla różnych składników. Jednym z takich buforów jest bufor glukozowo-tris-EDTA lub GTE.
Do czego służy GTE?
GTE służy do ponownego zawieszania osadu komórek bakteryjnych przed lizą (rozerwaniem) komórek i zebraniem plazmidowego DNA. Wraz z buforem GTE często dodawany jest lizozym, który zmiękcza błony komórkowe. Osiągnięcie jednorodnej zawiesiny całych komórek na tym etapie, tak aby dodany następnie roztwór do lizy mógł dostać się do wszystkich komórek, jest kluczem do uzyskania dobrej wydajności DNA. GTE zaprojektowano do tego, zapewniając jednocześnie stabilne środowisko dla DNA.
Glukoza na osmolarność
50mM (milimolowy) cukier glukozowy jest dodawany do buforu GTE w celu utrzymania osmolarności, w której stężenie substancji rozpuszczonej na zewnątrz komórek jest zbliżone do stężenia wewnątrz komórek. Zapobiega to przedwczesnej lizie komórek, która może powodować niższą wydajność DNA z powodu agregacji i degradacji. Pozostałe składniki buforu również przyczyniają się do osmolarności roztworu, ale glukoza, będąc nieelektrolitem, jest dobrym wyborem, ponieważ nie koliduje z buforem roztworu nieruchomości.
Tris dla stabilności pH
Tris to krótka nazwa tris (hydroksymetylo)aminometanu, który jest bardzo powszechnym buforem pH. W przypadku buforu GTE sól kwasowa (Tris-HCl) jest dodawana do buforu w stężeniu 25mM. Utrzymuje to pH roztworu na poziomie zbliżonym do fizjologicznego 8,0, idealnym pH do zapobiegania hydrolizie kwasowej (degradacji) plazmidowego DNA i niepożądanym reakcjom ubocznym innych składników komórki.
EDTA zapobiega degradacji DNA
EDTA, czyli kwas etylenodiaminotetraoctowy, wychwytuje lub „chelatuje” jony metali z roztworu, uniemożliwiając im udział w niepożądanych reakcjach ubocznych. W buforze GTE dodaje się EDTA w stężeniu 10 mM. Jego głównym celem jest zaokrąglanie w buforze wolnego cynku, magnezu i wapnia, zapobiegając w ten sposób degradacji DNA pewnymi szlakami, które wymagają tych metali.
Kilka ważnych wskazówek
Przechowuj bufor GTE w niskiej temperaturze i przygotuj go w małych ilościach, aby zapobiec rozwojowi w nim niezamierzonych bakterii. Cukier i kontrolowane pH to świetna pożywka wzrostowa. Zawsze używaj wody oczyszczonej. Woda z kranu może zawierać nadmiar jonów metali z rur, co może przeciążyć zdolność wychwytywania EDTA. Jeśli podejrzewasz obecność zakłócającego RNA w twojej próbce, dodaj RNazę A w ilości 100 mikrogramów na mililitr do buforu GTE, aby wyeliminować problem.