Sekwencjonowanie DNA: definicja, metody, przykłady

Nukleotydy są chemicznymi elementami budulcowymi życia i znajdują się w DNA organizmów żywych. Każdy nukleotyd składa się z cukier, fosforan i zasada zawierająca azot: adenina (A), tymina (T), cytozyna (C) i guanina (G). Specyficzna kolejność tych zasad nukleotydowych określa, które białka, enzymy i cząsteczki zostaną zsyntetyzowane przez komórkę.

Określenie kolejności lub sekwencji nukleotydów jest ważne dla badania mutacje, ewolucja, postęp choroby, testy genetyczne, śledztwo sądowe i medycyna.

Genomika to nauka o DNA, genach, interakcjach genów i wpływie środowiska na geny. Sekretem rozwikłania złożonego wewnętrznego działania genów jest możliwość zidentyfikowania ich struktury i lokalizacji na chromosomach.

Plan żywych organizmów jest określony przez kolejność (lub sekwencję) par zasad kwasu nukleinowego w DNA. Podczas replikacji DNA adenina paruje się z tyminą, a cytozyna z guaniną; brane są pod uwagę niedopasowane pary mutacje.

Od podwójnej helisy kwas dezoksyrybonukleinowy

Jednocześnie toczące się dyskusje pozwalają naukowcom wyprzedzać etyczne implikacje tak szybko eksplodujących technologii.

Sekwencjonowanie DNA to proces odkrywania sekwencji różnych zasad nukleotydowych we fragmentach DNA. Sekwencjonowanie całego genu umożliwia porównanie chromosomów i genomów występujących w tym samym i różnych gatunkach.

Mapowanie chromosomów jest przydatne w badaniach naukowych. Analiza mechanizmów i struktury geny, allele i mutacje chromosomalne w cząsteczkach DNA sugerują nowe sposoby leczenia zaburzeń genetycznych i na przykład powstrzymywania wzrostu guza nowotworowego.

Metody sekwencjonowania DNA Fredericka Sangera znacznie rozwinął dziedzinę genomiki, począwszy od lat 70. XX wieku. Sanger czuł się gotowy, by zająć się sekwencjonowaniem DNA po pomyślnym zsekwencjonowaniu RNA podczas badania insuliny. Sanger nie był pierwszym naukowcem, który parał się sekwencjonowaniem DNA. Jednak jego sprytne metody sekwencjonowania DNA – opracowane wspólnie z kolegami Bergiem i Gilbertem – zdobyły Nagrodę Nobla w 1980 roku.

Sanger znał potencjalną wartość swojej pracy i często współpracował z innymi naukowcami, którzy podzielali jego zainteresowania DNA, Biologia molekularna i nauk przyrodniczych.

Chociaż powolne i drogie w porównaniu z dzisiejszymi technologiami sekwencjonowania, metody sekwencjonowania DNA Sangera były wówczas chwalone. Po próbach i błędach Sanger znalazł sekretny biochemiczny „przepis” na oddzielanie nici DNA, tworzenie większej ilości DNA i identyfikowanie kolejności nukleotydów w genomie.

Materiały wysokiej jakości można łatwo kupić do użytku w badaniach laboratoryjnych:

• polimeraza DNA jest enzymem potrzebnym do wytworzenia DNA.
• Starter DNA mówi enzymowi, gdzie rozpocząć pracę nad nicią DNA.
• dNTP to cząsteczki organiczne składające się z cukru dezoksyrybozy i trifosforanów nukleozydów – dATP, dGTP, dCTP i dTTP – które gromadzą białka
• Terminatory łańcuchów to nukleotydy w kolorze barwnika, zwane również nukleotydami terminatorowymi dla każdej zasady – A, T, C i G.

Sanger odkrył, jak pociąć DNA na małe segmenty za pomocą enzymu polimerazy DNA.

Następnie wykonał więcej DNA z matrycy i wstawił znaczniki radioaktywne do nowego DNA, aby oddzielić sekcje oddzielonych nici. Uznał również, że enzym potrzebuje startera, który mógłby wiązać się z określonym miejscem na nici matrycy. W 1981 roku Sanger ponownie przeszedł do historii, odkrywając genom 16 000 par zasad mitochondrialnego DNA.

Podczas całego procesu sekwencjonowania należy dokładnie regulować temperaturę. Najpierw chemikalia są dodawane do rurki i podgrzewane w celu rozplątania (denaturacji) dwuniciowej Cząsteczka DNA. Następnie temperatura zostaje schłodzona, umożliwiając związanie podkładu.

Następnie podnosi się temperaturę, aby pobudzić optymalną aktywność polimerazy DNA (enzymu).

Polimeraza zazwyczaj wykorzystuje normalne dostępne nukleotydy, które dodaje się w wyższym stężeniu. Kiedy polimeraza dociera do „zakańczającego łańcuch” nukleotydu połączonego barwnikiem, polimeraza zatrzymuje się, a tam kończy się łańcuch, co wyjaśnia, dlaczego barwione nukleotydy nazywane są „zakańczającymi łańcuch” lub „terminatorzy”.

Proces ten trwa wiele, wiele razy. Ostatecznie, połączony barwnikiem nukleotyd został umieszczony w każdej pojedynczej pozycji sekwencji DNA. Elektroforeza żelowa i programy komputerowe mogą następnie zidentyfikować kolory barwników na każdej z nici DNA i ustalić całą sekwencję DNA na podstawie barwnika, pozycji barwnika i długości nici.

Sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości – ogólnie określany jako sekwencjonowanie nowej generacji – wykorzystuje nowe osiągnięcia i technologie do sekwencjonowania zasad nukleotydowych szybciej i taniej niż kiedykolwiek wcześniej. Maszyna do sekwencjonowania DNA może z łatwością obsługiwać odcinki DNA na dużą skalę. W rzeczywistości całe genomy można wykonać w ciągu godzin, zamiast lat za pomocą technik sekwencjonowania Sangera.

Metody sekwencjonowania nowej generacji mogą obsługiwać analizę DNA na dużą skalę bez dodatkowego etapu amplifikacji lub klonowania w celu uzyskania wystarczającej ilości DNA do sekwencjonowania. Maszyny do sekwencjonowania DNA przeprowadzają wiele reakcji sekwencjonowania jednocześnie, co jest tańsze i szybsze.

Zasadniczo, nowa technologia sekwencjonowania DNA przeprowadza setki reakcji Sangera na małym, czytelnym mikroczipie, który jest następnie uruchamiany przez program komputerowy, który składa sekwencję.

Technika odczytuje krótsze fragmenty DNA, ale nadal jest szybsza i bardziej wydajna niż metody sekwencjonowania Sangera, więc nawet projekty na dużą skalę można szybko ukończyć.

Projekt genomu człowieka, ukończony w 2003 roku, jest jednym z najbardziej znanych badań sekwencjonowania przeprowadzonych do tej pory. Według artykułu z 2018 roku w Wiadomości naukowe, ludzki genom składa się z około 46 831 genów, co było ogromnym wyzwaniem dla sekwencji. Najlepsi naukowcy z całego świata spędzili blisko 10 lat współpracując i konsultując się. Prowadzona przez National Human Genome Research

Instytut z powodzeniem zmapował ludzki genom przy użyciu próbki złożonej pobranej od anonimowych dawców krwi.

Projekt genomu ludzkiego opierał się na metodach sekwencjonowania sztucznych chromosomów bakteryjnych (opartych na BAC) w celu mapowania par zasad. Technika ta wykorzystywała bakterie do klonowania fragmentów DNA, co skutkowało dużą ilością DNA do sekwencjonowania. Klony następnie zmniejszano, umieszczano w maszynie do sekwencjonowania i składano w odcinki reprezentujące ludzkie DNA.

Nowe odkrycia w genomice dogłębnie zmieniają podejście do zapobiegania chorobom, ich wykrywania i leczenia. Rząd przeznaczył miliardy dolarów na badania DNA. Organy ścigania przy rozwiązywaniu spraw opierają się na analizie DNA. Zestawy do testowania DNA można kupić do użytku domowego, aby zbadać pochodzenie i zidentyfikować warianty genów, które mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia:

• Analiza genomowa pociąga za sobą porównywanie i kontrastowanie sekwencji genomów wielu różnych gatunków w domenach i królestwach życia. Sekwencjonowanie DNA może ujawnić wzorce genetyczne, które rzucają nowe światło, gdy pewne sekwencje zostały wprowadzone ewolucyjnie. Pochodzenie i migrację można prześledzić za pomocą analizy DNA i porównać z zapisami historycznymi.

• Postępy w medycynie Dzieje się w tempie wykładniczym, ponieważ praktycznie każda ludzka choroba ma składnik genetyczny. Sekwencjonowanie DNA pomaga naukowcom i lekarzom zrozumieć, w jaki sposób wiele genów oddziałuje ze sobą i ze środowiskiem. Szybkie sekwencjonowanie DNA nowego drobnoustroju powodującego wybuch choroby może pomóc w identyfikacji skutecznych leków i szczepionek, zanim problem stanie się poważnym problemem zdrowia publicznego. Warianty genów w komórkach nowotworowych i nowotworach można zsekwencjonować i wykorzystać do opracowania zindywidualizowanych terapii genowych.

• kryminalistyka aplikacje były wykorzystywane, aby pomóc organom ścigania w rozwiązaniu tysięcy trudnych spraw od końca lat 80., zgodnie z Narodowy Instytut Sprawiedliwości. Dowody z miejsca zbrodni mogą zawierać próbki DNA z kości, włosów lub tkanki ciała, które można porównać z profilem DNA podejrzanego w celu ustalenia winy lub niewinności. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest powszechnie stosowaną metodą tworzenia kopii DNA z dowodów śladowych przed sekwencjonowaniem.

• Sekwencjonowanie nowo odkrytych gatunków może pomóc w określeniu, które inne gatunki są najbliżej spokrewnione i ujawnić informacje o ewolucji. Taksonomiści używają „kodów kreskowych” DNA do klasyfikowania organizmów. Według Uniwersytet Gruzji w maju 2018 r. szacuje się, że 303 gatunki ssaków nie zostały jeszcze odkryte.

• Badania genetyczne pod kątem chorób szukaj zmutowanych wariantów genów. Większość z nich to polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP), co oznacza, że ​​tylko jeden nukleotyd w sekwencji został zmieniony z „normalnej” wersji. Czynniki środowiskowe i styl życia wpływają na to, jak i czy wyrażane są określone geny. Globalne firmy udostępniają najnowocześniejsze technologie sekwencjonowania nowej generacji naukowcom na całym świecie zainteresowanym interakcjami wielogenowymi i sekwencjonowaniem całego genomu.

• Zestawy genealogiczne DNA używać sekwencji DNA w swojej bazie danych, aby sprawdzić warianty w genach danej osoby. Zestaw wymaga próbki śliny lub wymazu z policzka, który jest wysyłany do laboratorium komercyjnego w celu analizy. Oprócz informacji o pochodzeniu niektóre zestawy mogą identyfikować polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) lub inne dobrze znane warianty genetyczne, takie jak geny BRCA1 i BRCA2 związane z podwyższonym ryzykiem kobiecej piersi i rak jajnika.

Nowe technologie często niosą ze sobą zarówno korzyści społeczne, jak i szkody; przykłady obejmują niesprawne elektrownie jądrowe i nuklearną broń masowego rażenia. Technologie DNA również wiążą się z ryzykiem.

Emocjonalne obawy związane z sekwencjonowaniem DNA i narzędziami do edycji genów, takimi jak CRISPR, obejmują obawy, że: technologia może ułatwić klonowanie ludzi lub doprowadzić do zmutowanych zwierząt transgenicznych stworzonych przez łotra naukowiec.

Częściej kwestie etyczne związane z sekwencjonowaniem DNA wiążą się ze świadomą zgodą. Łatwy dostęp do testów DNA bezpośrednio dla konsumentów oznacza, że ​​konsumenci mogą nie w pełni rozumieć, w jaki sposób ich informacje genetyczne będą wykorzystywane, przechowywane i udostępniane. Ludzie świeccy mogą nie być emocjonalnie gotowi do poznania swoich wadliwych wariantów genów i zagrożeń dla zdrowia.

Strony trzecie, takie jak pracodawcy i firmy ubezpieczeniowe, mogą potencjalnie dyskryminować osoby, które mają wadliwe geny, które mogą powodować poważne problemy zdrowotne.