Zalety korzystania z enzymów Sticky End

Klonowanie molekularne jest powszechną metodą biotechnologiczną, którą powinien znać każdy student i badacz. Klonowanie molekularne przy użyciu rodzaju enzymu zwanego enzymem restrykcyjnym do cięcia ludzkiego DNA na fragmenty, które można następnie wstawić do plazmidowego DNA komórki bakteryjnej. Enzymy restrykcyjne przecinają dwuniciowy DNA na pół. W zależności od enzymu restrykcyjnego, cięcie może skutkować lepkim lub tępym końcem. Lepkie końce są bardziej przydatne w klonowaniu molekularnym, ponieważ zapewniają wstawienie fragmentu ludzkiego DNA do plazmidu we właściwym kierunku. Proces ligacji lub łączenia fragmentów DNA wymaga mniej DNA, gdy DNA ma lepkie końce. Na koniec, wiele enzymów restrykcyjnych z lepkimi końcami może wytwarzać ten sam lepki koniec, nawet jeśli każdy enzym rozpoznaje inną sekwencję restrykcyjną. Zwiększa to prawdopodobieństwo, że interesujący Cię region DNA może zostać wycięty przez enzymy z lepkimi końcami.

Enzymy restrykcyjne to enzymy, które przecinają, rozpoznają określone sekwencje na dwuniciowym DNA i przecinają DNA na pół w tej sekwencji. Rozpoznana sekwencja nazywana jest miejscem restrykcyjnym. Enzymy restrykcyjne nazywane są endonukleazami, ponieważ tną dwuniciowe DNA, w taki sposób normalnie istnieje DNA, w miejscach pomiędzy końcami DNA. Istnieje ponad 90 różnych enzymów restrykcyjnych. Każdy rozpoznaje odrębną witrynę z ograniczeniami. Enzymy restrykcyjne rozszczepiają swoje odpowiednie miejsca restrykcyjne 5000 razy wydajniej niż inne miejsca, których nie rozpoznają.

Enzymy restrykcyjne dzielą się na dwie ogólne klasy. Albo tną DNA na lepkie końce, albo na tępe końce. Lepki koniec ma krótki region nukleotydów, cegiełek budulcowych DNA, który jest niesparowany. Ten niesparowany region nazywa się nawisem. Mówi się, że nawis jest lepki, ponieważ chce i będzie sparowany z innym lepkim końcem, który ma komplementarną sekwencję nawisu. Lepkie końce są jak dawno zagubione bliźniaki, które chcą się mocno przytulić, gdy się spotkają. Z drugiej strony, tępe końce nie są lepkie, ponieważ wszystkie nukleotydy są już sparowane między dwiema nićmi DNA. Zaletą lepkich końców jest to, że fragment ludzkiego DNA może zmieścić się w plazmidzie bakteryjnym tylko w jednym kierunku. W przeciwieństwie do tego, jeśli zarówno ludzki DNA, jak i plazmid bakteryjny mają tępe końce, ludzki DNA można wstawić do plazmidu głowa-ogon lub ogon-głowa.

Chociaż DNA z patyczkowatymi końcami łatwiej się odnajduje ze względu na ich „lepkość”, ani lepkie końce, ani tępe końce nie mogą się połączyć w ciągły fragment DNA. Utworzenie ciągłego kawałka DNA, który jest całkowicie połączony, wymaga enzymu zwanego ligazą. Ligazy łączą szkielety nukleotydów na lepkich lub tępych końcach, tworząc ciągły łańcuch nukleotydów. Ponieważ lepkie końce odnajdują się szybciej ze względu na wzajemne przyciąganie, proces ligacji wymaga mniej ludzkiego DNA i mniej plazmidowego DNA. Tępe końce DNA i plazmidów z mniejszym prawdopodobieństwem odnajdą się nawzajem, a zatem ligacja tępych końców wymaga umieszczenia większej ilości DNA w probówce.

Miejsca restrykcyjne znajdują się w całym genomie organizmów, ale nie są równomiernie rozmieszczone. W plazmidach można je zaprojektować tak, aby znajdowały się tuż obok siebie. Naukowcy, którzy chcą wyciąć fragment ludzkiego DNA z ludzkiego genomu, muszą znaleźć miejsca restrykcyjne znajdujące się z przodu iz tyłu regionu fragmentu. Oprócz zapewnienia, że ​​fragment DNA jest wstawiony we właściwym kierunku, różne enzymy lepkiego końca mogą tworzyć ten sam lepki koniec, nawet jeśli rozpoznają różne sekwencje restrykcyjne. Na przykład BamHI, BglII i Sau3A mają różne sekwencje rozpoznawania, ale wytwarzają ten sam lepki koniec GATC. Zwiększa to prawdopodobieństwo pojawienia się miejsc restrykcyjnych z lepkimi końcami, które otaczają interesujący nas ludzki gen.