Według strony internetowej BioWeb Uniwersytetu Wisconsin, starter PCR to krótki, syntetyczny oligonukleotyd (zazwyczaj od 18 do 25 zasad) stosowany do amplifikacji określonych regionów DNA w technice biologii molekularnej znanej jako reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR). Potrzebny jest zarówno starter do przodu, jak i do tyłu, zaprojektowane jako odwrotne komplementy nici DNA, aby flankować i wiązać się z pożądanym regionem DNA. Kiedy naukowcy chcą przeprowadzić badania na określonym genie lub regionie DNA, najpierw muszą wykonać PCR, aby uzyskać wystarczającą ilość docelowego regionu do pracy. Zaprojektowanie sekwencji starterów dla interesującego regionu może być konieczne, jeśli nie są one już dostępne w ramach wcześniej opublikowanych badań lub środkami komercyjnymi.
Uzyskaj sekwencję nukleotydową genu lub interesującego regionu DNA i zdecyduj, jak długo fragment chcesz amplifikować. Starter przedni i wsteczny mają wiązać się na początku i na końcu pożądanego fragmentu. Zazwyczaj konwencjonalne metody PCR wykorzystują startery, które flankują region o długości od 100 do 1000 par zasad, podczas gdy metody PCR w czasie rzeczywistym wykorzystują fragmenty o długości około 50 do 200 par zasad.
Zdecyduj, gdzie w sekwencji chcesz umieścić startery. Na przykład możesz potrzebować lokalizacji w pobliżu końca 5' lub 3' sekwencji lub w środku. W razie potrzeby wyznacz lokalizację starterów obejmującą intron.
Zaprojektuj podkłady o długości od 18 do 24 zasad. Vincent R. Prezioso, Ph.D., z Brinkmann Instruments Inc., sugeruje, że ta długość jest wystarczająco długa, aby być wyjątkowo specyficzna dla pożądanego regionu DNA, ale wystarczająco krótka, aby łatwo wiązać się (anneal). Temperatura topnienia podkładu (Tm) powinna wynosić od 55 do 80 stopni Celsjusza, wystarczająco niska, aby umożliwić całkowite stopienie w temperaturze 90 stopni Celsjusza lub powyżej, ale wystarczająco wysoka, aby umożliwić wyżarzanie. Zawartość GC (procent Gs i Cs w sekwencji) powinna wynosić od 40 do 60 procent. Koniec 3' sekwencji startera powinien kończyć się C lub G (zwanym zaciskiem GC), aby promować wiązanie, ponieważ G i C nukleotydy mają silniejsze wiązania, jednak unikaj posiadania trzech lub więcej G lub C w ostatnich pięciu zasadach sekwencji.
Unikaj wykonywania czterech lub więcej powtórzeń jednej zasady (takich jak ACCCC...) lub czterech lub więcej powtórzeń dinukleotydowych (takich jak ATATATAT...), ponieważ mogą one powodować nieprawidłowe startery. Zaprojektuj startery bez homologii wewnątrzstarterowej (więcej niż trzy zasady, które uzupełniają się w ramach jednej) startera) lub homologia między starterami (gdzie starter przedni i wsteczny mają komplementarność sekwencje). Może to powodować samo-dimery lub startery-dimery, w których startery wiążą się ze sobą zamiast wiązać się z pożądaną sekwencją DNA.
Korzystaj z zasobów i witryn internetowych, które pomagają w projektowaniu starterów lub pomagają sprawdzić sekwencje starterów pod kątem samokomplementarności lub możliwości tworzenia struktur drugorzędowych, takich jak spinki do włosów. Niektóre strony internetowe z projektami starterów obejmują Primer3 Massachusetts Institute of Technology, Primer-Blast firmy National Center for Biotechnology Information oraz OligoAnalyzer firmy Integrated DNA Technologies.