Jak pobierana jest próbka DNA i przygotowywana do badań

Zanim będą mogli zsekwencjonować DNA lub zmienić je za pomocą inżynierii genetycznej, naukowcy muszą najpierw je wyizolować. Może się to wydawać trudnym zadaniem, ponieważ komórki zawierają wiele innych związków, takich jak białka, tłuszcze, cukry i małe cząsteczki. Na szczęście biolodzy mogą wykorzystać właściwości chemiczne DNA do oddzielenia DNA od tych zanieczyszczeń i przygotowania go do dalszych badań. Ten proces nazywa się ekstrakcją DNA.

Do ekstrakcji DNA stosuje się wiele różnych technik. To, z którego korzysta poszczególne laboratorium, zależy od rodzaju przeprowadzanego eksperymentu i tego, jak czyste musi być DNA. Naukowcy zazwyczaj zaczynają od próbki zawierającej komórki – na przykład tkanki lub próbki krwi – i rozbijają komórki lub poddają je lizie. Istnieje wiele sposobów lizy komórek. Dodanie detergentu spowoduje ich rozpadanie się, podobnie jak poddanie ich działaniu fal dźwiękowych o wysokiej częstotliwości. Alternatywnie, zmieszanie próbki z kulkami szklanymi i gwałtowne jej wibrowanie spowoduje fizyczne rozbicie komórek i uwolnienie ich zawartości.

Jeśli wysoka czystość nie jest wymagana, naukowcy mogą dodać enzym zwany proteinazą K, aby rozłożyć większość białek w próbce, a następnie użyć go bez zmian. Ta technika jest jednak bardzo brudna, ponieważ większość zanieczyszczeń jest nadal obecna, więc jest odpowiednia tylko wtedy, gdy priorytetem jest szybkość, a czystość nie stanowi problemu. Innym szybkim i brudnym podejściem jest usunięcie białek poprzez zwiększenie stężenia soli poprzez dodanie soli, takich jak octan amonu lub potasu, aby zmusić białka do wytrącenia. Ta technika również jest dość brudna, ponieważ wiele innych zanieczyszczeń jest nadal obecnych.

Innym podejściem jest liza komórek detergentem, a następnie zmieszanie roztworu z alkoholem izoamylowym, chloroformem i fenolem. Następnie roztwór rozdziela się na dwie warstwy. Białka trafiają do górnej warstwy organicznej, podczas gdy DNA pozostaje w dolnej warstwie wodnej. Ta technika wymaga starannej kontroli stężenia soli i pH w celu uzyskania dobrych wyników. Jest to czasochłonne, a zarówno fenol, jak i chloroform są wysoce toksycznymi chemikaliami. W konsekwencji, podczas gdy ekstrakcje fenolowo-chloroformowe były kiedyś rutynowe, inne techniki stały się bardziej popularne w ostatnich latach.

Chromatografia anionowymienna zapewnia wyższą czystość i bardziej spójne wyniki niż ekstrakcja fenolowo-chloroformowa. Probówka lub kolumna jest wypełniona małymi cząstkami, na których znajdują się dodatnio naładowane miejsca, w których może wiązać się ujemnie naładowana cząsteczka lub anion. DNA wiąże się z tymi miejscami wymiany anionów, podczas gdy inne zanieczyszczenia, takie jak białka i RNA, są wypłukiwane z kolumny. Później do usunięcia DNA z kolumny stosuje się roztwór bogaty w sól.

Najszybszą i prawdopodobnie najbardziej niezawodną techniką oczyszczania DNA jest użycie specjalnie wyprodukowanego zestawu. Zestawy te zawierają membrany z żelu krzemionkowego w tubie. DNA przykleja się do membrany, podczas gdy inne zanieczyszczenia są wypłukiwane za pomocą serii specjalnie przygotowanych roztworów soli dołączonych do zestawu. Na koniec DNA jest wypłukiwane z kolumny roztworem o niskiej zawartości soli. Zestawy te są szybkie, łatwe w użyciu i zapewniają powtarzalne wyniki.

Po wyizolowaniu DNA i zawieszeniu go w roztworze buforowym o kontrolowanym pH, ostatnim krokiem jest sprawdzenie jego czystości. Prostym i wygodnym sposobem na to jest sprawdzenie, ile światła ultrafioletowego pochłania przy długościach fali 260 i 280 nanometrów. Absorpcja przy 260 nanometrach podzielona przez absorpcję przy 280 nanometrach powinna wynosić 1,8, jeśli DNA jest czyste. Pomiar absorbancji przy 260 nanometrach umożliwia również określenie stężenia DNA.