Western blot jest jedną z najczęstszych procedur w laboratoriach biochemicznych. Zasadniczo oddziela białka od próbki według wielkości, a następnie testuje przy użyciu przeciwciał, aby określić, czy dane białko jest obecne. Jest przydatny nie tylko w badaniach, ale także w laboratoriach medycznych lub diagnostycznych; testy na HIV i boreliozę, na przykład, obejmują test immunoenzymatyczny (ELISA), a następnie Western blot, jeśli wynik testu ELISA jest pozytywny. Jednak pomimo swojej popularności Western blotting ma kilka wad.
Nieilościowe
Klasyczne Western blot nie są ilościowe. Innymi słowy, chociaż mogą powiedzieć naukowcom, czy dane białko jest obecne, nie umożliwiają ilościowego określenia, ile białka jest obecne. Niektóre firmy biotechnologiczne sprzedają teraz zestawy, które umożliwiają naukowcom lub technikom laboratoryjnym określenie ilości amount białko obecne przy użyciu krzywej standardowej -- ale działa to tylko wtedy, gdy są czyste próbki tego samego białka dostępny. Co więcej, masę cząsteczkową białka można oszacować tylko za pomocą Western blot, a nie dokładnie określić, jak za pomocą spektrometrii masowej.
Przeciwciała
Western blot można przeprowadzić tylko wtedy, gdy dostępne są pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Chociaż przeciwciała dla wielu różnych białek są dostępne w firmach biotechnologicznych, nie są one tanie; jeśli przeciwciała pierwszorzędowe nie są dostępne dla danego białka, wykonanie Western blot w poszukiwaniu tego konkretnego białka nie będzie możliwe. Co więcej, naukowcy mogą chcieć ustalić, czy białko zostało w jakiś sposób zmodyfikowane - czy zostało ufosforylowane (miało na przykład dołączona do niego grupa fosforanowa), a przy technice Western blot potrzebują przeciwciał specyficznych dla zmodyfikowanej białko.
Trening
Prawidłowe wykonanie Western blot i uzyskanie dobrych wyników może być trudne, dlatego personel musi być dobrze przeszkolony. W tym, podobnie jak w wielu innych, najlepszym nauczycielem jest prawdopodobnie doświadczenie; jednak nawet dla doświadczonego technika zachodnia plama jest czasochłonna. Na przykład, część eksperymentu polegająca na elektroforezie żelowej trwa zwykle od jednej do dwóch godzin. Inne zadania można oczywiście wykonywać w trakcie działania żelu, ale uzyskanie wyników eksperymentu nadal zajmuje trochę czasu.
Inne ograniczenia
Przeciwciała mogą czasami wykazywać pewne wiązanie niezgodne z celem, co może skutkować gorszymi wynikami. Co więcej, w Western blottingu używasz przeciwciała przeciwko określonemu białku, więc twoje wyniki pokażą ci tylko, czy to białko było obecne. Natomiast spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości ujawnia wszystkie białka obecne w próbce i w przeciwieństwie do klasycznego Western blotting jest to ilościowe. Należy oczywiście pamiętać, że spektrometria mas jest znacznie droższa, a także trudniejsza technicznie w użyciu w porównaniu z techniką Western blot.