Jak powstaje rekombinowane DNA?

Rekombinowany DNA (kwas dezoksyrybonukleinowy) to syntetyczny typ kwasu nukleinowego utworzony przez połączenie DNA sekwencje razem, które naturalnie nie istniałyby w normalnych warunkach i środowisku warunki.

Proces tworzenia rekombinowanego DNA jest zwykle wykonywany przy użyciu rekombinowanego plazmidu. W szczególności powstaje w wyniku zaawansowanej procedury technologii DNA stosowanej w biologii i genetyce, znanej jako klonowanie genów. Rekombinowany DNA jest umieszczany w komórce, która następnie wytwarza zupełnie nowe białko i jest wykorzystywana do syntezy leków, przeciwciał lub specyficznych białek wyłącznie do celów badawczych.

DNA z organizmu dawcy lub źródła biologicznego jest najpierw ekstrahowane z komórek, a następnie poddawane procesowi cięcia znanemu jako restrykcja enzymatyczna. To generuje fragmenty DNA, które zawierają interesujący gen lub geny. Fragmenty te można następnie „sklonować” (tj. wstawić) lub nakleić na fragmenty z organizmu biorcy.

Następnie wstawia się je do większych cząsteczek DNA ("rekombinowanego plazmidu"), które umieszcza się w bakterii i pozwala się im rozmnażać. Rekombinowany DNA jest następnie odzyskiwany i weryfikowany.

Przeczytaj więcej o zaletach i wadach technologii rekombinacji DNA.

DNA musi najpierw zostać wyekstrahowane i oczyszczone z innych cząsteczek komórkowych, takich jak kwasy rybonukleinowe (RNA), białka i struktury, takie jak błony komórkowe. Do celów klonowania DNA jest uzyskiwany z jądra i jest znany jako „genomowy DNA”. Jedna wspólna metoda dla DNA ekstrakcja polega na ultrawirowaniu składników komórkowych w gradiencie gęstości utworzonym z bromku etydyny w cezie chlorek.

Alternatywnie, do odzyskania DNA można również użyć serii płukań alkalicznych i buforowanych solą. Gdy zostanie on wytrącony i oczyszczony ze wszystkich innych niechcianych zanieczyszczeń, DNA można pociąć na fragmenty.

Enzymy restrykcyjne to enzymy, które tną bardzo specyficzne sekwencje DNA; służą do tworzenia unikalnych fragmentów DNA. Proces ten zapewnia, że ​​żadne niedokładne, nieprawidłowe lub niepożądane sekwencje nie są generowane i nie stają się przypadkowo włączone do ostatecznego rekombinowanego DNA, co może skutkować zarówno niepowodzeniem eksperymentu, jak i śmierć komórki.

Aby wygenerować pożądane fragmenty DNA, do cięcia lub trawienia DNA stosuje się określony pojedynczy (lub kombinację) enzymu (enzymów). Fragmenty są następnie oczyszczane przez elektroforezę żelową, która oddziela je od niechcianego DNA. Prymitywniejsza metoda technologii DNA polega po prostu na mechanicznym ścinaniu, które rozrywa dłuższe segmenty DNA na mniejsze, które można wykorzystać do klonowania.

Ligacja to proces sklejania lub łączenia ze sobą fragmentów DNA dawcy i biorcy (lub wektora) w celu utworzenia rekombinowanej cząsteczki plazmidowego DNA. Idealnie, enzymy restrykcyjne wybrane do tworzenia fragmentów byłyby bardzo dokładnie przemyślane i zaprojektowane tak, aby umożliwiały ułożenie tych kawałków jak puzzle.

W tym celu preferowane są enzymy restrykcyjne, które wytwarzają zgodne „lepkie końce”, takie, że wszystkie zgodne fragmenty naturalnie połączą się ze sobą. W przeciwnym razie enzym ligaza DNA może być użyty do połączenia segmentów DNA wiązaniami fosfodiestrowymi.

Proces transformacji lub szoku cieplnego jest wykorzystywany do wprowadzenia rekombinowanej cząsteczki DNA do komórki bakteryjnej gospodarza, która może następnie wygenerować wiele kopii syntetycznego DNA. Bakterie te hoduje się na płytkach agarowych, hoduje w specjalnych bulionach bakteryjnych, a następnie poddaje lizie w celu uwolnienia zrekombinowanego DNA. Wreszcie DNA można zweryfikować przez sekwencjonowanie DNA, eksperymenty funkcjonalne i trawienie enzymami restrykcyjnymi.

Technologia rekombinacji DNA jest wykorzystywana do wszystkiego, od eksperymentów w laboratoriach akademickich po tworzenie leków farmaceutycznych. Jest to również ważna część sekwencjonowania DNA i identyfikacji genów.

Możesz przeczytać więcej o zastosowaniach tego Technologia DNA tutaj.

Przeczytaj więcej o różnicy między rekombinowanym DNA a inżynierią genetyczną.