Biochemicy i biolodzy molekularni wykorzystują elektroforezę do oddzielania makrocząsteczek, takich jak białka i kwasy nukleinowe. Pozwala to naukowcom izolować i analizować pojedyncze białka lub sekwencje kwasów nukleinowych w złożonej mieszaninie. Typowym przykładem elektroforezy w laboratorium jest mikrobiolog stosujący reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) do oddzielania fragmentów DNA wytwarzanych w społeczności drobnoustrojów. Niezależnie od celu elektroforeza zawsze wymaga użycia roztworu buforowego.
TL; DR (zbyt długi; Nie czytałem)
Elektroforeza oddziela makrocząsteczki, takie jak białka i kwasy nukleinowe, według wielkości, ładunku i innych właściwości. W przypadku elektroforezy, która rozdziela się na podstawie ładunku, naukowcy używają buforu do przepuszczania tego ładunku przez żel. Bufor utrzymuje również żel w stabilnym pH, minimalizując zmiany, które mogą wystąpić w białku lub kwasie nukleinowym, jeśli zostanie poddany niestabilnemu pH.
Zasady elektroforezy
Elektroforeza rozdziela cząsteczki wzdłuż gradientu w oparciu o ich rozmiar, ładunek lub inne właściwości. Gradientem tym może być pole elektryczne lub, w przypadku denaturującej elektroforezy żelowej gradientowej (DGGE), środek denaturujący, taki jak mieszanina mocznika i formamidu. Białka będą migrować w kierunku anody, jeśli są naładowane ujemnie, a katody, jeśli są naładowane dodatnio. Ponieważ większe molekuły migrują wolniej niż mniejsze molekuły, naukowcy mogą zmierzyć przebytą odległość i użyć logarytmów do określenia rozmiaru fragmentów.
Gradientowa elektroforeza żelowa denaturująca
W przypadku DGGE DNA porusza się wzdłuż gradientu rosnącej mocy denaturującej, aż siła ta jest wystarczająca do całkowitego zdenaturowania lub rozwinięcia tego konkretnego fragmentu DNA. W tym momencie migracja się zatrzymuje. Naukowcy mogą wykorzystać tę metodę do rozdzielania fragmentów na podstawie ich indywidualnej podatności na denaturację.
Co robi bufor
W przypadku elektroforezy, która rozdziela na podstawie ładunku, jony w buforze przekazują ładunek niezbędny do rozdziału. Bufor, zapewniając rezerwuar słabego kwasu i zasady, również utrzymuje pH w wąskim zakresie. Jest to ważne, ponieważ struktura i ładunek białka lub kwasu nukleinowego ulegną zmianie, jeśli zostaną poddane znacznym zmianom pH, uniemożliwiając w ten sposób prawidłową separację.
Typowe bufory
Różne bufory są idealne do utrzymywania żelu do elektroforezy w różnych pożądanych zakresach pH. Typowymi buforami stosowanymi przez naukowców w tym celu są kwas octowy, kwas borowy, kwas fosforowy i kwas cytrynowy oraz glicyna i tauryna. Ogólnie wartość pKa (stała dysocjacji kwasu) powinna być zbliżona do wymaganego pH. Preferujemy od nas bufory, które zapewniają niską wielkość ładunku, aby nie przewodzić zbyt dużego prądu.