Podczas pracy z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC) dobra kalibracja jest absolutnie niezbędna do zapewnienia wiarygodnych, wysokiej jakości wyników. Właściwa kalibracja przyrządu HPLC rozpoczyna się od wykonania odpowiedniego wzorca kalibracyjnego. W większości przypadków kalibracja w rzeczywistości wymaga serii wzorców o rosnącym stężeniu w celu wytworzenia tak zwanej krzywej kalibracyjnej. Jest to wykreślona linia i powiązane równanie, które opisuje zależność między stężeniem badanej substancji chemicznej a odpowiedzią detektora HPLC.
Określ substancję chemiczną, którą chcesz przetestować za pomocą HPLC („analit”). Na przykład możesz chcieć przetestować serię napojów bezalkoholowych na zawartość fruktozy, w którym to przypadku fruktoza będzie analitem.
Uzyskać odpowiednią ilość analitu o odpowiedniej czystości. Normalnie czystość powinna wynosić powyżej 99%, a analit powinien być kupowany od renomowanej firmy zajmującej się dostawą chemikaliów. Na przykład w przypadku fruktozy czystą fruktozę kupiłbyś od sprzedawcy chemikaliów, a nie ze sklepu spożywczego.
Określ maksymalne i minimalne przewidywane stężenia analitu w próbkach, które zamierzasz zbadać za pomocą HPLC. W przypadku napojów bezalkoholowych należy zbadać etykiety napojów i określić najniższą i najwyższą zawartość fruktozy wśród badanych napojów. Należy pamiętać, że początkowa próbka (napój bezalkoholowy) może być rozcieńczona lub w inny sposób manipulowana podczas przygotowywania do analizy (w zależności od stosowanej metody HPLC), a zatem stężenie analitu w próbkach faktycznie wstrzykiwanych do HPLC może być zmodyfikowany. Należy wziąć pod uwagę stężenie analitu w próbkach analizowanych metodą HPLC.
Określ rozpuszczalnik, w którym rozpuścisz analit, aby stworzyć standardy kalibracji. Rozpuszczalnik ten musi być w stanie prawidłowo rozpuścić analit w stosunkowo szerokim zakresie stężeń (przynajmniej tak wysokim jak w próbkach, które zamierzasz przetestować). Również ten rozpuszczalnik powinien być idealnie podobny do „fazy ruchomej”: rozpuszczalnika używanego do przenoszenia próbek przez aparat HPLC.
Oblicz ilość analitu wymaganą do sporządzenia „wzorcowego roztworu podstawowego” analitu. Oblicza się to mnożąc wymagane stężenie wzorca podstawowego przez żądaną objętość. Stężenie analitu w tym roztworze powinno być co najmniej o 10% wyższe niż najwyższe przewidywane stężenie próbki. Jeżeli najwyższe przewidywane stężenie fruktozy w próbce napoju wynosi 8 gramów/100 mililitrów, wówczas standardem zapasowym może być stężenie 10 gramów fruktozy/100 mililitrów. Rozsądna objętość to 500 mililitrów, zatem wymagane byłoby 8/100 ml x 500 ml = 40 gramów fruktozy.
Odważ wymaganą ilość analitu z odpowiednią precyzją. Często odpowiednia jest wartość wagi w gramach z dokładnością do jednego lub dwóch miejsc po przecinku, ale w przypadku niektórych metod może być potrzebna większa precyzja.
Przenieść zważony analit do kolby miarowej o wymaganej objętości i dodać żądany rozpuszczalnik do oznaczenia napełnienia na kolbie. Użycie kolby miarowej (zamiast na przykład zlewki miarowej) zwiększa precyzję wartości stężenia wzorca podstawowego. Upewnij się, że cały analit został przeniesiony do kolby; w razie potrzeby użyj rozpuszczalnika, aby go zmyć.
Wykonać serię różnych rozcieńczeń wzorca podstawowego, przenosząc znane objętości wzorca podstawowego do kolb miarowych, używając pipet w celu dokładnego przeniesienia, a następnie dodając rozpuszczalnik. Najniższe stężenie wzorca powinno być poniżej najniższej przewidywanej próbki do analizy. W przykładzie napoju bezalkoholowego, jeśli najniższe oczekiwane stężenie fruktozy w próbce wynosi 2 gramy/100 ml, wówczas można wytworzyć wzorzec 1 gram/100 ml. Byłoby to dokonane przez dziesięciokrotne rozcieńczenie standardu podstawowego. Standardowe serie powinny zawierać w sumie 5 lub 6 stężeń, więc wymagane byłyby dodatkowe rozcieńczenia w celu wytworzenia wzorców około 3, 5 i 8 gramów fruktozy/ml. Masz teraz serię roztworów wzorcowych, za pomocą których można kalibrować HPLC.