Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) to technika laboratoryjna stosowana do oddzielania i identyfikacji związków. Jest to rodzaj chromatografii kolumnowej, która polega na różnych polarnościach związków w roztworze w celu ich rozdzielenia. HPLC różni się od standardowej chromatografii kolumnowej, ponieważ wykorzystuje ciśnienie do szybszego przetłaczania roztworu przez kolumnę, a zatem daje szybsze, a czasem dokładniejsze wyniki. Celem jest oddzielenie związków w kolumnie i oddzielne ich wyjście.
Ze względu na szybkość HPLC i zależność od różnych polarności związków, dwa związki o podobna struktura i polaryzacja może wychodzić z aparatu chromatograficznego w tym samym lub prawie takim samym czasie czas. Nazywa się to koelucją. Koelucja utrudnia dokładne określenie, która porcja mieszaniny uległa elucji w jakim punkcie.
HPLC zazwyczaj wykorzystuje szklaną kolumnę wypełnioną kulkami wykonanymi z różnych materiałów. Mieszaniny przetłaczane przez kolumnę zawierają substancje chemiczne, które z różną siłą wiążą się z kulkami. Siła wiązania, która zależy od podobieństwa polarności, określa, jak długo substancja chemiczna zwiąże się z kulką przed uwolnieniem. Niektóre związki wiążą się tak silnie, że zasadniczo nigdy nie są uwalniane z kulek w kolumnie i nigdy nie są mierzone w roztworze opuszczającym kolumnę.
Typowe laboratoryjne techniki separacji obejmują opracowanie testu lub metody separacji, a następnie wdrożenie tego testu w celu oddzielenia poszczególnych związków od roztworu. Jednak zwykle skutkuje to wieloma rozwiązaniami, które również muszą przejść procedury, co prowadzi do wykładniczego wzrostu złożoności. Chociaż HPLC często może uprościć i przyspieszyć ten proces, koszt opracowania aparatu do HPLC może stać się ogromny. Opracowanie aparatu do HPLC, choć znacznie wydajniejsze, jest znacznie bardziej kosztowne niż opracowanie innych testów do rozdzielania związków. To sprawia, że nie jest to opłacalne finansowo dla wielu małych prywatnych laboratoriów.
HPLC służy nie tylko do oddzielania prostych związków, ale także do izolowania określonych białek z mieszaniny komórkowej. W takim przypadku kulki w kolumnie są zwykle pokryte przeciwciałem specyficznym dla białka, które chcesz zebrać. Białka wiążą przeciwciała, a pozostały roztwór przechodzi przez kolumnę, a następnie białka są uwalniane przy użyciu innego roztworu i zbierane. Wymaga to wysoko wykwalifikowanego technika do ciągłego monitorowania kolumny i upewniania się, że proces przebiega dokładnie zgodnie z planem.
