Elektroforeza jest „potężną i niedrogą techniką separacji molekularnej”, jak stwierdził dr William H. Heidcamp, w Podręczniku Laboratorium Biologii Komórki. Istnieją różne powody przeprowadzania elektroforezy, w tym nieinwazyjne wiązanie cząsteczek i wizualizacja rozdziału cząsteczek. Ogólnie rzecz biorąc, elektroforeza ma na celu zapewnienie dokładnego sposobu analizy substancji, takich jak krew i DNA (kwas dezoksyrybonukleinowy), które są trudne do oddzielenia przy użyciu konwencjonalnych metod.
Definicja
Elektroforeza to technika empiryczna stosowana do rozdzielania naładowanych cząsteczek (dodatnich i ujemnych), takich jak komórki i białka, zgodnie z ich odpowiedzią na prąd elektryczny.
Na elektroforezę wpływa kilka czynników, w tym ładunek netto, masa cząsteczki, bufor i media elektroforetyczne, takie jak papier lub żel. W elektroforezie cząsteczki poruszają się w kierunku przeciwnego ładunku; na przykład białko o dodatnim ładunku netto przesuwa się w kierunku ujemnej strony ośrodka elektroforetycznego. Ponadto cząsteczki o mniejszej masie poruszają się szybciej lub rozdzielają się szybciej niż cząsteczki o większej masie.
Historia
W 1937 roku szwedzki naukowiec Arne Tiselius opracował aparat do pomiaru ruchu cząsteczek białka, zwany aparatem Moving Boundary. Jest to aparat w kształcie litery U, który wykorzystuje środowisko wodne do oddzielania cząsteczek białka.
W 1940 roku wprowadzono elektroforezę strefową, która wykorzystuje podłoże stałe (np. żel) i umożliwia barwienie w celu uzyskania lepszej rozdzielczości lub wizualizacji rozdziału cząsteczek.
Następnie w 1960 roku opracowano elektroforezę kapilarną, aby zapewnić wszechstronną technikę elektroforezy. Ten rodzaj elektroforezy umożliwia rozdzielanie cząsteczek przy użyciu pożywek wodnych i stałych.
Wiązanie cząsteczek
Elektroforeza przy użyciu pożywek celowo oddziałuje z cząsteczkami w sposób nieinwazyjny. Na przykład nośniki żelowe wiążą się z cząsteczkami białka bez zakłócania struktury i funkcji białka. Po związaniu z cząsteczkami ruch lub separacja jest inicjowana przez przyłożenie prądu elektrycznego. Ponadto możliwe jest również odzyskanie cząsteczek związanych z pożywką po elektroforezie.
Separacja w wysokiej rozdzielczości
Elektroforeza służy do wizualizacji rozdziału cząsteczek. Osiąga się to różnymi metodami, w tym barwieniem i autoradiografią.
Autoradiografia wykorzystuje filmy rentgenowskie do wizualizacji położenia cząsteczek radioaktywnych (np. DNA) po rozdzieleniu. Ten rodzaj wizualizacji jest porównywalny do robienia zdjęć, gdzie prześwietlenie jest jak lampa błyskowa aparatu, a klisza rentgenowska jest jak klisza używana do wywoływania czarno-białych zdjęć. W elektroforezie zdjęcia cząsteczek, takich jak białka we krwi, są opracowywane za pomocą autoradiografii.
Podczas barwienia barwniki takie jak błękit Coomassie i czerń amidowa są mieszane z cząsteczkami przed lub po procesie separacji. Na przykład mieszanie białek z barwnikiem Coomasie przed elektroforezą da wybarwione ścieżki (małe kropki lub linie) pokazujące ruch białka podczas separacji.
Analiza ilościowa
Innym celem elektroforezy jest uzyskanie informacji ilościowych po wizualizacji rozdziału cząsteczek. Aby uzyskać dane ilościowe, na przykład oprogramowanie do analizy obrazu (oprogramowanie do renderowania 2D i 3D) rejestruje wyniki elektroforezy jako sygnały cyfrowe. Sygnały te reprezentują położenie cząsteczek przed i po elektroforezie i są następnie wykorzystywane do analizy ilościowej „in silico” (przy użyciu komputera).