Kjemikere bruker høyytelses væskekromatografi, eller HPLC, for å skille blandinger av forbindelser. Generelt består metoden av å injisere en prøve i en kolonne hvor den blandes med ett eller flere løsemidler. Forskjellige forbindelser adsorberer eller "stikker" til kolonnen i forskjellige grader; og når løsningsmidlet skyver forbindelsene gjennom kolonnen, vil en av komponentene i blandingen først komme ut av kolonnen. Instrumentet oppdager forbindelsene når de kommer ut av kolonnen og produserer et kromatogram som består av et plott med retensjonstid på x-aksen og signalintensitet fra detektoren på y-aksen. Når forbindelsene går ut av kolonnen, produserer de "topper" i kromatogrammet. Generelt, jo lenger fra hverandre og jo smalere toppene i kromatogrammet, jo høyere er oppløsningen. Forskere anser en oppløsning på 1.0 eller høyere for å representere en adekvat separasjon.
Mål bredden på to tilstøtende topper i kromatogrammet ved å merke hvor x-akseverdiene er ved foten av hver topp. X-aksen representerer retensjonstid, vanligvis målt i sekunder. Dermed, hvis en topp begynner på 15,1 sekunder og slutter på 18,5 sekunder, er bredden (18,5 - 15,1) = 3,4 sekunder.
Bestem retensjonstidene ved å merke tiden, dvs. plasseringen på x-aksen, som tilsvarer plasseringene til toppene. Denne verdien vil normalt være omtrent halvveis mellom de to verdiene som brukes til å beregne bredden i trinn 1. Eksemplet gitt i trinn 1, for eksempel, ville ha et maksimum på omtrent 16,8 sekunder.
Beregn oppløsningen, R, mellom to topper ved å:
R = \ frac {RT_1-RT_2} {0.5 (W_1 + W_2)}
hvor RT1 og RT2 representerer retensjonstidene for toppene 1 og 2, og W1 og W2 representerer bredden på toppene tatt ved basene. Fortsetter eksemplet fra trinn 2 og 3, viser en topp en retensjonstid på 16,8 sekunder og en bredde på 3,4 sekunder. Hvis den andre toppen hadde en retensjonstid på 21,4 sekunder med en bredde på 3,6 sekunder, ville oppløsningen være:
R = \ frac {21.4-16.8} {0.5 (3.4 + 3.6)} = 1.3
Ting du trenger
- HPLC-kromatogram
- Kalkulator