Hva er frysebrudd og hvorfor er det nyttig i cellebiologi?

Cellemembraner består av fosfolipider og festede eller innebygde proteiner. Membranproteiner spiller viktige roller i metabolismen og livet til cellen. Du kan ikke bruke vanlig mikroskopi for å visualisere eller karakterisere adhesjonsproteiner, transportere proteiner og proteinkanaler i cellemembranen. Ved hjelp av elektronmikroskopi og en teknikk kalt "fryse fraktur", som deler frosne cellemembraner fra hverandre, tillater visualisering av membranstrukturen og organisering av proteiner i havet av fosfolipider. Å kombinere andre metoder med frysefrakturer hjelper oss ikke bare med å forstå strukturen til forskjellige cellemembraner og membranproteiner, men tillater visualisering og detaljert analyse av funksjonen til spesifikke proteiner, bakterier og virus.

Ved hjelp av flytende nitrogen fryses biologiske vevsprøver eller celler raskt for å immobilisere cellebestanddeler. Cellemembraner er sammensatt av to lag av fosfolipider, kalt et dobbeltlag, der de hydrofobe, eller vannhatende, lipidhalene peker mot innsiden av membranen og de hydrofile, eller vannelskende, endene av lipidmolekylet peker utover og mot innsiden av celle. Den frosne prøven er sprukket eller sprukket med en mikrotom, som er et knivlignende instrument for kutting av tynne vevskiver. Dette får cellemembranen til å splitte fra hverandre nøyaktig mellom de to lagene fordi tiltrekningen mellom de hydrofobe lipidhalene representerer det svakeste punktet. Etter brudd gjennomgår prøven en vakuumprosedyre, kalt "fryseetsing." Bruddets overflate prøven skygges med karbon og platindamp for å lage en stabil replika som følger konturene av bruddet flyet. Syre brukes til å fordøye organisk materiale som fester seg til replikaen, og etterlater et tynt platinskall av den sprukne membranoverflaten. Dette skallet blir deretter analysert ved elektronmikroskopi.

Frysetsning er vakuumtørking av en ubundet, frossen og frysefrakket biologisk prøve. Vakuumtørkeprosedyren ligner på frysetørking av frukt og grønnsaker som pakkes og selges i dagligvarebutikker. Uten fryseetsning er mange detaljer i mobilstrukturen skjult av iskrystaller. Dyp- eller fryseetsingstrinnet forbedrer og utvider den opprinnelige fryse-bruddmetoden, slik at observasjon av cellemembraner under forskjellige aktiviteter. Det muliggjør analyse av ikke bare membranstrukturen, men også av intracellulære komponenter og gir detaljert strukturell informasjon om bakterier, virus og stort cellulært protein komplekser.

Elektronmikroskopi kan avsløre og forstørre mer enn en million ganger de minste organismer eller strukturer, slik som bakterier, virus, intracellulære komponenter og til og med proteiner. Visualisering er skapt ved å bombardere en ultratynn prøve med en elektronstråle. De to elektronmikroskopimetodene er skanningelektronmikroskopi, eller SEM, og overføringselektronmikroskopi, eller TEM. Frysebruddprøver analyseres rutinemessig med TEM. TEM har bedre oppløsning enn SEM og tilbyr strukturell informasjon ned til 3 nanometer kopier.

Utviklingen og bruken av fryse fraktur elektronmikroskopi viste at celleplasma membraner består av lipid dobbeltlag og avklart hvordan proteiner er organisert i cellemembraner. Frysebrudd gir et unikt utseende på det indre av cellemembraner, fordi det splitter og skiller membranfosfolipider i to motsatte og komplementære ark eller ansikter. I mer enn 50 år siden introduksjonen av den første frysefrakturmaskinen, er det fortsatt å lage en platina-replika den eneste måten å få strukturell informasjon om cellemembranen. Teknikken viser om spesifikke proteiner flyter eller er forankret i cellemembranen, og om og hvordan noen proteiner samler seg. En nyere metode - ved bruk av antistoffer som er målrettet mot spesifikke proteiner - kombineres med frysebrudd for å identifisere proteiner og deres funksjon i cellemembranen.