Tris, eller tris (hydroksymetyl) aminometan, er en vanlig biologisk buffer som brukes gjennom DNA-ekstraksjonsprosessen. Under ekstraksjon fra et hvilket som helst antall kilder er DNA pH-følsomt. Under cellelyse, fjerning av uønskede mobilkomponenter og utfelling, brukes tris for å opprettholde en stabil pH. I tillegg spiller den en spesielt viktig rolle i cellelyse.
TL; DR (for lang; Leste ikke)
DNA-ekstraksjon er en pH-sensitiv prosess, og bruk av en tris-buffer hjelper å holde pH stabil over cellelyse og ekstraksjon.
Tris som en buffer
Ettersom pH kan påvirke og bli påvirket av en rekke cellulære faktorer, er det viktig å opprettholde en stabil pH for eksperimentell vitenskap. Biologiske buffere, som tris, er viktige fordi de kan opprettholde en stabil pH til tross for påvirkninger som ellers kan forandre pH. Tris (hydroksymetyl) aminometan, med en pKa på 8,1, er en effektiv buffer mellom pH 7 og 9. På grunn av sitt nøytrale område er tris en ofte brukt buffer i biologiske laboratorier. Tris-buffer er imidlertid temperaturfølsom og bør brukes ved temperaturen som den opprinnelig ble pH-verdi for å unngå unøyaktighet.
Lyse av celler
Lyse, eller å bryte opp cellene, er det første trinnet med DNA-ekstraksjon. Dette oppnås med en buffer som inneholder tris og EDTA (etylendiamintetraeddiksyre). EDTA binder toverdige kationer som kalsium og magnesium. Siden disse ionene hjelper med å opprettholde integriteten til cellemembranen, destabiliserer membranen ved å eliminere dem med EDTA. Tris er den viktigste bufferkomponenten; dens viktigste rolle er å holde pH i bufferen på et stabilt punkt, vanligvis 8,0. I tillegg tris interagerer sannsynligvis med LPS (lipopolysakkarid) i membranen, og tjener til å destabilisere membranen lengre.
Tris beskytter DNA mot pH-skift
Når cellene brytes fra hverandre, søles DNA og innhold i bufferen. I tillegg er ofte RNase A (ødelegger RNA), proteaser (ødelegger proteiner) og SDS (natriumdodecylsulfat, solubiliserer membranfragmentene) inkludert. Tilsammen kan denne suppen med cellulært innhold og fragmentert RNA og proteiner ha stor innvirkning på pH i løsningen. Fordi DNA er pH-sensitivt, er det viktig for tris å buffer suppen og opprettholde pH på et jevnt punkt.
DNA Nedbør
I sluttfasen av DNA-ekstraksjon blir selve DNA ekstrahert fra løsningen. På dette punktet er DNA løselig i bufferen. For å ekstrahere fra løsningen blir DNA gjort uoppløselig ved å tilsette etanol eller isopropanol (isopropylalkohol). Når dette er gjort, blir DNA tydelig i løsningen som et hvitt, allerede stoff. Selv om DNA kan isoleres fra de gjenværende mobilkomponentene på denne måten, er det ikke "brukbart" når det er uoppløselig. Etter isolasjon fjernes alkoholen, og DNA må returneres til en biologisk buffer, som tris, for å bli brukt.
Gjør det selv
Selv om ekstraksjon av DNA ofte gjøres i forskningslaboratorier, bruker man vanligvis en av flere kommersielt tilgjengelige sett, alle kan gjøre DNA-ekstraksjon hjemme ved hjelp av vanlige husholdningsartikler og grønt erter eller spinat. I dette tilfellet er ikke tris, eller noen biologisk buffer, til stede for å beskytte DNA mot pH-skift. Det er imidlertid en visuell måte å hjelpe studenter med å få kontakt med mobil DNA.