Ulempene med Western Blotting

Western blotting er en av de vanligste prosedyrene i biokjemiske laboratorier. I utgangspunktet skiller det proteiner fra en prøve etter størrelse, og tester deretter med antistoffer for å bestemme om et gitt protein er til stede. Det er ikke bare nyttig i forskning, men også i medisinske eller diagnostiske laboratorier; tester for både HIV og Lyme sykdom, for eksempel, involverer en enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) test, etterfulgt av en Western blot hvis ELISA tester positivt. Til tross for populariteten har Western blotting imidlertid flere ulemper.

Klassiske Western blots er ikke-kvantitative. Med andre ord, mens de kan fortelle forskere om et bestemt protein er til stede, gjør de det ikke mulig å kvantifisere hvor mye av proteinet som er tilstede. Noen bioteknologiske selskaper selger nå sett som gjør det mulig for forskere eller laboratorieteknikere å kvantifisere mengden protein til stede ved hjelp av en standardkurve - men dette fungerer bare hvis det er rene prøver av det samme proteinet tilgjengelig. Videre kan molekylvekten til et protein bare estimeres med Western-blotting, i stedet for å bestemmes nøyaktig som med massespektrometri.

En Western blot kan bare utføres hvis primære antistoffer mot proteinet av interesse er tilgjengelige. Mens antistoffer for mange forskjellige proteiner er tilgjengelige fra bioteknologiske selskaper, er de ikke billige; hvis primære antistoffer ikke er tilgjengelige for et gitt protein, vil det ikke være mulig å utføre en Western blot på jakt etter det bestemte proteinet. Videre vil forskere kanskje bestemme om et protein har blitt modifisert på en eller annen måte - hvis det har blitt fosforylert (hadde en fosfatgruppe festet til den), for eksempel - og med Western blot-teknikken trenger de antistoffer som er spesifikke for det modifiserte protein.

Det kan være utfordrende å utføre en Western blot på riktig måte og få gode resultater, så personalet må være godt trent. I dette som i mye annet er erfaring kanskje den beste veileder; selv for en erfaren tekniker er imidlertid en Western blot tidkrevende. Gelelektroforesedelen av eksperimentet vil for eksempel typisk ta fra en til to timer å kjøre. Andre oppgaver kan selvfølgelig utføres mens gelen går, men eksperimentet tar fremdeles ganske lang tid å få resultater.

Antistoffer kan noen ganger utvise en viss binding utenfor målet, noe som kan gi dårligere resultater. Videre, med Western blotting, bruker du et antistoff mot et spesifikt protein, så resultatene dine vil bare fortelle deg om det proteinet var til stede. Høyoppløselig massespektrometri, derimot, avslører alle proteinene som er tilstede i en prøve, og i motsetning til klassisk Western-blotting er den kvantitativ. Det er viktig å huske, selvfølgelig, at massespektrometri er mye dyrere og også mer teknisk utfordrende å bruke sammenlignet med Western blotting.