Når du arbeider med høykvalitets væskekromatografi (HPLC), er god kalibrering helt avgjørende for å sikre pålitelige kvalitetsresultater. Riktig kalibrering av et HPLC-instrument begynner med å lage en passende kalibreringsstandard. I de fleste tilfeller krever kalibrering faktisk en rekke standarder for økende konsentrasjon for å produsere det som er kjent som en kalibreringskurve. Dette er en tegnet linje og tilhørende ligning som beskriver forholdet mellom konsentrasjonen av kjemikaliet som testes for og responsen fra HPLC-detektoren.
Bestem kjemikaliet du vil teste for ved hjelp av HPLC ("analytten"). For eksempel kan det være lurt å teste en serie med brus for fruktoseinnhold, i hvilket tilfelle fruktose vil være analytten.
Få en mengde analytisk kjemikalie med passende renhet. Normalt bør renheten være over 99%, og analytten skal kjøpes fra et anerkjent kjemikalieforsyningsselskap. I tilfelle fruktose, for eksempel, vil du kjøpe ren fruktose fra en kjemisk leverandør og ikke fra en matbutikk.
Bestem maksimale og minste forventede konsentrasjoner av analytten i prøvene du har tenkt å teste på HPLC. Når det gjelder brus, vil du undersøke etikettene på drikkene og bestemme det laveste og høyeste fruktoseinnholdet blant drikkene du vil teste. Husk at den første prøven (brus) kan fortynnes eller på annen måte manipuleres under forberedelse for analyse (avhengig av HPLC-metoden som brukes) og slik kan analytkonsentrasjonen i prøvene som faktisk injiseres på HPLC være endret. Det er analytkonsentrasjonen i prøvene som kjøres på HPLC som må vurderes.
Bestem løsningsmidlet der du vil oppløse analytten din for å utgjøre kalibreringsstandarder. Dette løsningsmidlet må være i stand til å oppløse analytten riktig over et relativt bredt konsentrasjonsområde (minst like høyt som i prøvene du har tenkt å teste). I tillegg bør dette løsningsmidlet ideelt sett være ganske likt den "mobile fasen:" løsningsmidlet som brukes til å bære prøver gjennom HPLC-instrumentet.
Beregn mengden analyt som kreves for å lage en "stamstandard" -løsning av analytten. Dette blir funnet ved å multiplisere den nødvendige konsentrasjonen av lagerstandarden med ønsket volum. Konsentrasjonen av analytten i denne løsningen bør være minst 10% høyere enn den høyeste forventede prøvekonsentrasjonen. Hvis den høyeste forventede fruktosekonsentrasjonen i en brusprøve er 8 gram / 100 milliliter, kan lagerstandarden gjøres til en konsentrasjon på 10 gram fruktose / 100 milliliter. Et rimelig volum er 500 milliliter, og det vil derfor være behov for 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fruktose.
Vei den nødvendige mengden analyt til et passende presisjonsnivå. Ofte er en vektverdi i gram nøyaktig til en eller to desimaler egnet, men mer presisjon kan være nødvendig for noen metoder.
Overfør den veide analyt til en målekolbe med nødvendig volum og tilsett ønsket løsningsmiddel til fyllmerket på kolben. Bruk av en målekolbe (i stedet for en gradert beger, for eksempel) øker presisjonen til lagerstandardkonsentrasjonsverdien. Forsikre deg om at all analyt er overført til kolben; bruk noe av løsningsmidlet til å vaske det inn, om nødvendig.
Lag en serie med forskjellige fortynninger av lagerstandarden ved å overføre kjente volumer av lagerstandarden til volumetriske kolber, ved å bruke pipetter for nøyaktig overføring og deretter tilsette løsemiddel. Den laveste standardkonsentrasjonen bør være under den laveste forventede prøven som skal analyseres. I bruseksemplet, hvis den laveste forventede fruktosekonsentrasjonen i en prøve er 2 gram / 100 ml, kan det lages en standard på 1 gram / 100 ml. Dette vil bli gjort ved en tidobbelt fortynning av aksjestandarden. Standardserien bør inneholde totalt 5 eller 6 konsentrasjoner, så ytterligere fortynninger for å produsere standarder på kanskje 3, 5 og 8 gram fruktose / ml vil være nødvendig. Du har nå en serie standardløsninger som du kan kalibrere HPLC med.