DNA-klonen: definitie, proces, voorbeelden

Het is mogelijk om hele organismen zoals Dolly het schaap te klonen, maar DNA-klonen is anders. Het maakt gebruik van moleculair-biologische technieken om identieke kopieën van DNA-sequenties of enkele genen.

Met behulp van genetische manipulatiemethoden worden segmenten van de genetische DNA-code geïdentificeerd en geïsoleerd. DNA-klonering kopieert vervolgens de Nucleïnezuur sequenties in de segmenten.

De resulterende identieke kopieën kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek of voor biotechnologische toepassingen. Vaak codeert het gen dat gekopieerd wordt voor een eiwit dat deel kan uitmaken van medische behandelingen. DNA-technologie inclusief: DNA klonen ondersteunt het begrip van hoe genen werken en hoe de genetische code van mensen het functioneren van het lichaam beïnvloedt.

DNA-klonering is het moleculair-biologische proces waarbij identieke kopieën worden gemaakt van DNA-segmenten in de chromosomen die de genetische code van geavanceerde organismen bevatten.

Het proces genereert grote hoeveelheden van de doel-DNA-sequenties. Het doel van DNA-klonering is om de doelwit-DNA-sequenties zelf te produceren of om de eiwitten te produceren die in de doelwitsequenties worden gecodeerd.

De twee methoden die worden gebruikt bij het klonen van DNA worden genoemd: plasmide vector en polymerasekettingreactie (PCR). In de plasmide vector methode, DNA-strengen worden gesneden met behulp van restrictie-enzymen om DNA-fragmenten te produceren, en de resulterende segmenten worden ingevoegd in kloneringsvectoren die plasmiden worden genoemd voor verdere duplicatie. De plasmiden worden in bacteriële cellen geplaatst die vervolgens de DNA-kopieën of gecodeerde eiwitten produceren.

In de PCR-methode:, het segment van de te dupliceren DNA-strengen is gemarkeerd met enzymen genaamd primers. Een polymerase-enzym maakt kopieën van het gemarkeerde deel van de DNA-streng. Deze methode maakt geen gebruik van restrictie-enzymen en kan uit kleine monsters gekloond DNA produceren. Soms worden de twee DNA-technologiemethoden samen gebruikt om de beste eigenschappen van elk in een algemene reactie op te nemen.

De vector van de methode verwijst naar het plasmide dat wordt gebruikt om het te klonen doel-DNA-segment vast te houden. Plasmiden zijn kleine cirkelvormige strengen van niet-chromosomaal DNA gevonden in veel organismen, waaronder bacteriën en virussen.

Bacteriële plasmiden zijn de vector die wordt gebruikt voor het invoegen van het doel-DNA-segment in bacteriële cellen voor verdere duplicatie.

Het doel-DNA selecteren en isoleren: Voordat het DNA-kloneringsproces kan beginnen, moeten de DNA-sequenties worden geïdentificeerd, vooral het begin en de uiteinden van de DNA-segmenten.

Dergelijke DNA-sequenties kunnen worden gevonden door gebruik te maken van bestaand gekloond DNA met bekende sequenties of door het door de doel-DNA-sequentie geproduceerde eiwit te bestuderen. Zodra de sequentie bekend is, kunnen de overeenkomstige restrictie-enzymen worden gebruikt.

Het doel-DNA knippen met restrictie-enzymen: Restrictie-enzymen worden geselecteerd om te zoeken naar de DNA-code aan het begin en einde van de doelsequenties.

Wanneer de restrictie-enzymen een speciaal gecodeerde reeks basenparen vinden die restrictieplaatsen worden genoemd, hechten zich op die plaats aan het DNA en winden zich om het DNA-molecuul, waardoor de strand. De geknipte DNA-segmenten die de doelsequentie bevatten, zijn nu beschikbaar voor duplicatie.

De plasmidevector kiezen en het doel-DNA invoegen: Een geschikt plasmide bevat idealiter dezelfde DNA-coderende sequenties als de DNA-streng waaruit het doelwit-DNA is geknipt. De cirkelvormige DNA-streng van het plasmide wordt geknipt met dezelfde restrictie-enzymen die werden gebruikt voor het knippen van het doel-DNA.

EEN DNA-ligase-enzym wordt gebruikt om het koppelen van DNA-segmenten te bevorderen, en de uiteinden van het doel-DNA-segment verbinden zich met de afgesneden uiteinden van het plasmide-DNA. Het doel-DNA maakt nu deel uit van de circulaire plasmide-DNA-streng.

Het plasmide in een bacteriële cel plaatsen: Zodra het plasmide de te klonen DNA-sequentie bevat, kan het eigenlijke klonen plaatsvinden met behulp van een proces genaamd bacteriële transformatie. De plasmiden worden ingebracht in een bacteriële cel zoals E. coli, en de cellen met de nieuwe DNA-segmenten zullen kopieën en de bijbehorende eiwitten gaan produceren.

Bij bacteriële transformatie worden de gastheercellen en plasmiden gedurende ongeveer 12 uur samen bij lichaamstemperatuur geïncubeerd. De cellen absorberen een deel van de plasmiden en behandelen ze als hun eigen plasmide-DNA.

Het gekloonde DNA en de eiwitten oogsten: De meeste plasmiden die worden gebruikt voor DNA-klonering hebben: genen voor antibioticaresistentie opgenomen in hun DNA. Naarmate de bacteriecellen de nieuwe plasmiden opnemen, worden ze resistent tegen antibiotica.

Wanneer de kweek wordt behandeld met antibiotica, overleven alleen die cellen die de nieuwe plasmiden hebben opgenomen. Het resultaat is een zuivere kweek van bacteriële cellen met gekloond DNA. Dat DNA kan dan worden geoogst of het bijbehorende eiwit kan worden geproduceerd.

De PCR methode is eenvoudiger en kopieert bestaand DNA op zijn plaats. Het vereist niet knippen met restrictie-enzymen of inbrengen plasmideDNA opeenvolgingen. Dit maakt het bijzonder geschikt voor het klonen van DNA-monsters met een beperkt aantal DNA-strengen. Hoewel de methode DNA kan klonen, kan het niet worden gebruikt voor de productie van het overeenkomstige eiwit.

Het afrollen van de DNA-strengen: DNA in chromosomen is strak opgerold in een dubbele helixstructuur. Het DNA verhitten tot 96 graden Celsius in een proces genaamd denaturatie zorgt ervoor dat het DNA-molecuul zich ontrolt en in twee strengen splitst. Deze scheiding is vereist omdat slechts één enkele DNA-streng tegelijk kan worden gekloond.

Het selecteren van de primers: Net als bij het klonen van plasmidevector-DNA, moeten de te kloneren DNA-sequenties worden geïdentificeerd met speciale nadruk op het begin en de uiteinden van de DNA-segmenten. Primers zijn enzymen die zich hechten aan specifieke DNA-codesequenties en ze moeten worden geselecteerd om de doel-DNA-segmenten te markeren. De juiste primers zullen hechten aan de DNA-molecuulsequenties om het begin en einde van de doelsegmenten te markeren.

Gloeien van de reactie om de primers te binden: Het afkoelen van de reactie tot ongeveer 55 graden Celsius heet gloeien. Naarmate de reactie afkoelt, worden de primers geactiveerd en hechten ze zich aan de DNA-streng aan elk uiteinde van een doel-DNA-segment. De primers werken alleen als markers en de DNA-streng hoeft niet te worden geknipt.

Het produceren van identieke kopieën van het doel-DNA-segment: In een proces genaamd uitbreiding, wordt het warmtegevoelige TAQ-polymerase-enzym aan de reactie toegevoegd. De reactie wordt vervolgens verwarmd tot 72 graden Celsius, waardoor het enzym wordt geactiveerd. Het actieve DNA-polymerase-enzym bindt aan de primers en kopieert de DNA-sequentie ertussen. Het initiële DNA-sequencing- en kloneringsproces is voltooid.

De opbrengst van gekloond DNA verhogen: Het initiële annealing- en verlengingsproces creëert relatief weinig kopieën van de beschikbare DNA-strengsegmenten. Om de opbrengst te verhogen door extra DNA-replicatie, wordt de reactie opnieuw gekoeld om de primers opnieuw te activeren en ze te laten binden aan andere DNA-strengen.

Vervolgens activeert het opnieuw verwarmen van de reactie het polymerase-enzym weer en worden er meer kopieën geproduceerd. Deze cyclus kan 25 tot 30 keer worden herhaald.

De plasmidevectormethode is gebaseerd op een ruime initiële toevoer van DNA om te knippen en in plasmiden in te voegen. Te weinig origineel DNA resulteert in minder plasmiden en een langzame start van de productie van gekloond DNA.

De PCR-methode kan een grote hoeveelheid DNA produceren uit enkele originele DNA-strengen, maar omdat het DNA niet in een bacteriële cel is geïmplanteerd, is eiwitproductie niet mogelijk.

Om het eiwit te produceren dat wordt gecodeerd in de DNA-fragmenten die moeten worden gekloneerd uit een klein aanvankelijk DNA-monster, kunnen de twee methoden samen worden gebruikt, en ze kunnen elkaar aanvullen. Eerst wordt de PCR-methode gebruikt om DNA uit een klein monster te klonen en veel kopieën te maken.

Vervolgens worden de PCR-producten gebruikt met de plasmidevectormethode om het geproduceerde DNA in bacteriële cellen te implanteren die het gewenste eiwit zullen produceren.

Moleculaire biologie maakt gebruik van genklonering en DNA-replicatie voor medische en commerciële doeleinden. De bacteriën met gekloonde DNA-sequenties worden gebruikt om medicijnen te maken en om stoffen te vervangen die mensen met genetische aandoeningen niet zelf kunnen aanmaken.

Typische toepassingen zijn onder meer:

• Het gen voor menselijke insuline wordt gekloond in bacteriën die vervolgens de insuline produceren die door diabetici wordt gebruikt.
• Weefselplasminogeenactivator wordt geproduceerd uit gekloond DNA en wordt gebruikt om te helpen bloedstolsels voorkomen.
• Menselijk groeihormoon kan worden geproduceerd en toegediend aan mensen die het zelf niet kunnen produceren.

Biotechnologie maakt ook gebruik van het klonen van genen in de landbouw om nieuwe eigenschappen bij planten en dieren te creëren of bestaande eigenschappen te verbeteren. Naarmate er meer genen worden gekloond, neemt het aantal mogelijke toepassingen exponentieel toe.

DNA-moleculen vormen een klein deel van het materiaal in een levende cel en het is moeilijk om de invloeden van de vele genen te isoleren. De DNA-kloneringsmethoden leveren grote hoeveelheden van een specifieke DNA-sequentie op om te bestuderen, en het DNA produceert eiwitten net als in de oorspronkelijke cel. DNA-klonering maakt het mogelijk om deze operatie voor verschillende genen afzonderlijk te bestuderen.

Typische toepassingen voor onderzoek en DNA-technologie omvatten het onderzoeken van:

• Functie van een gen.
• Mutaties van een gen.
• Genexpressie.
• Gen producten.
• Genetische defecten.

Wanneer meer DNA-sequenties worden gekloond, is het gemakkelijker om extra sequenties te vinden en te klonen. De bestaande gekloonde DNA-segmenten kunnen worden gebruikt om te bepalen of een nieuw segment overeenkomt met het oude en welke delen anders zijn. Het identificeren van een doel-DNA-sequentie is dan sneller en nauwkeuriger.

In gentherapiewordt een gekloond gen aangeboden aan de cellen van een organisme waarvan het natuurlijke gen is beschadigd. Een vitaal gen dat een eiwit produceert dat nodig is voor een specifieke organismefunctie, kan worden gemuteerd, veranderd door straling of worden aangetast door virussen.

Als het gen niet goed werkt, ontbreekt er een belangrijke stof in de cel. Gentherapie probeert vervang het gen door een gekloonde versie die de vereiste stof zal produceren.

Gentherapie is nog experimenteel en er zijn maar weinig patiënten genezen met behulp van de techniek. De problemen liggen bij het identificeren van het enkele gen dat verantwoordelijk is voor een medische aandoening en het afleveren van veel kopieën van het gen aan de juiste cellen. Omdat DNA-klonering meer wijdverbreid is geworden, is gentherapie in verschillende specifieke situaties toegepast.

Recente succesvolle toepassingen omvatten:

• Ziekte van Parkinson: Met behulp van een virus als vector werd een aan de ziekte van Parkinson gerelateerd gen in de middenhersenen van patiënten geïnjecteerd. Patiënten ervoeren verbeterde motorische vaardigheden zonder nadelige bijwerkingen.
• Adenosinedeaminase (ADA)-deficiëntie: Een genetische immuunstoornis werd behandeld door de bloedstamcellen van patiënten te verwijderen en het ADA-gen in te brengen. Patiënten waren daardoor in staat om ten minste een deel van hun eigen ADA te produceren.
• Hemofilie: Mensen met hemofilie produceren geen specifieke eiwitten die de bloedstolling helpen. In de levercellen van patiënten werd een gen ingebracht voor de aanmaak van een van de ontbrekende eiwitten. Patiënten produceerden het eiwit en bloedingsincidenten werden verminderd.

Gentherapie is een van de meest veelbelovende toepassingen van DNA-klonering, maar andere nieuwe toepassingen zullen waarschijnlijk toenemen naarmate meer DNA-sequenties worden bestudeerd en hun functie wordt bepaald. DNA-klonering levert de grondstof voor genetische manipulatie in de benodigde hoeveelheden.

Wanneer de rol van genen bekend is en hun juiste functie kan worden verzekerd door vervanging van defecte genen, veel chronische ziekten en zelfs kanker kunnen op genetisch niveau worden aangevallen en behandeld met behulp van DNA technologie.

Gerelateerde inhoud:

• Koloniekenmerken van E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: definitie, functie, structuur