Volgens de BioWeb-website van de University of Wisconsin is een PCR-primer een korte, synthetische oligonucleotide (meestal tussen 18 tot 25 basen lang) gebruikt om specifieke DNA-gebieden te amplificeren in een moleculair-biologische techniek die bekend staat als polymerasekettingreactie (PCR). Er zijn zowel een voorwaartse als een achterwaartse primer nodig, ontworpen om omgekeerde complementen van de DNA-streng te zijn, om te flankeren en te binden aan het gewenste DNA-gebied. Wanneer wetenschappers onderzoek willen doen naar een specifiek gen of een specifiek DNA-gebied, moeten ze eerst PCR uitvoeren om voldoende van het doelgebied te verwerven om mee te werken. Het ontwerpen van primersequenties voor het interessegebied kan nodig zijn als ze nog niet beschikbaar zijn via eerder gepubliceerd onderzoek of met commerciële middelen.
Verkrijg de nucleotidesequentie van het gen of het DNA-gebied van belang en beslis hoe lang een fragment u wilt amplificeren. De voorwaartse en achterwaartse primer is ontworpen om aan het begin en aan het einde van het gewenste fragment te binden. Gewoonlijk gebruiken conventionele PCR-methoden primers die een gebied tussen 100 en 1000 basenparen lang flankeren, terwijl real-time PCR-methoden fragmenten gebruiken van ongeveer 50 tot 200 basenparen lang.
Bepaal waar in de volgorde u de primers wilt laten liggen. U wilt bijvoorbeeld de locatie in de buurt van het 5'- of het 3'-uiteinde van de reeks of in het midden. Geef desgewenst de locatie van de primers aan om een intron te overspannen.
Ontwerp primers met een lengte van 18 tot 24 basen. Vincent R. Prezioso, Ph. D., van Brinkmann Instruments Inc., suggereert dat deze lengte lang genoeg is om extreem specifiek te zijn voor het gewenste DNA-gebied, maar kort genoeg om gemakkelijk te binden (annealen). De smelttemperatuur van de primer (Tm) moet tussen 55 en 80 graden Celsius zijn, laag genoeg om volledig te smelten bij of boven 90 graden Celsius, maar hoog genoeg om uitgloeien mogelijk te maken. Het GC-gehalte (percentage G's en C's in de reeks) moet tussen 40 en 60 procent zijn. Het 3'-uiteinde van de primersequentie moet eindigen op een C of een G (een GC-klem genoemd) om binding te bevorderen, aangezien de G en C nucleotiden hebben sterkere bindingen, maar vermijd drie of meer G's of C's in de laatste vijf basen van de sequentie.
Vermijd runs van vier of meer van één base (zoals ACCCC...) of vier of meer herhalingen van di-nucleotiden (zoals ATATATAT...) omdat ze verkeerde priming kunnen veroorzaken. Ontwerp primers zonder intra-primer homologie (meer dan drie basen die complementair zijn binnen de ene) primer zelf) of homologie tussen de primers (waarbij de forward en reverse primer complementair zijn) opeenvolgingen). Dit kan zelfdimeren of primer-dimeren veroorzaken, waarbij de primers aan zichzelf binden in plaats van aan de gewenste DNA-sequentie.
Gebruik online bronnen en websites die helpen bij het ontwerpen van primers of helpen bij het controleren van primersequenties op zelfcomplementariteit of het potentieel om secundaire structuren zoals haarspelden te maken. Sommige websites voor het ontwerpen van primers zijn Primer3 van het Massachusetts Institute of Technology, Primer-Blast van het National Center for Biotechnology Information en OligoAnalyzer van Integrated DNA Technologies.