Western blotting is een van de meest voorkomende procedures in biochemische laboratoria. Kortom, het scheidt eiwitten van een monster op grootte en test vervolgens met behulp van antilichamen om te bepalen of een bepaald eiwit aanwezig is. Het is niet alleen nuttig bij onderzoek, maar ook in medische of diagnostische laboratoria; tests voor zowel HIV als de ziekte van Lyme omvatten bijvoorbeeld een enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) -test, gevolgd door een Western-blot als de ELISA-test positief is. Ondanks zijn populariteit heeft Western blotting echter verschillende nadelen.
niet-kwantitatief
Klassieke Western-blots zijn niet-kwantitatief. Met andere woorden, hoewel ze onderzoekers kunnen vertellen of een bepaald eiwit aanwezig is, maken ze het niet mogelijk om te kwantificeren hoeveel van het eiwit aanwezig is. Sommige biotechbedrijven verkopen nu kits waarmee onderzoekers of laboratoriumtechnici de hoeveelheid kunnen kwantificeren eiwit aanwezig met behulp van een standaardcurve -- maar dit werkt alleen als zuivere monsters van hetzelfde eiwit zijn beschikbaar. Bovendien kan het molecuulgewicht van een eiwit alleen worden geschat met Western blotting, in plaats van precies te worden bepaald zoals met massaspectrometrie.
Antilichamen
Een Western-blot kan alleen worden uitgevoerd als primaire antilichamen tegen het betreffende eiwit beschikbaar zijn. Hoewel antilichamen voor veel verschillende eiwitten verkrijgbaar zijn bij biotechbedrijven, zijn ze niet goedkoop; als er geen primaire antilichamen beschikbaar zijn voor een bepaald eiwit, zal het niet mogelijk zijn om een Western-blot uit te voeren op zoek naar dat specifieke eiwit. Bovendien willen onderzoekers misschien bepalen of een eiwit op de een of andere manier is gemodificeerd - als het gefosforyleerd is (had een fosfaatgroep eraan vastgemaakt), bijvoorbeeld -- en met de Western blot-techniek hebben ze antilichamen nodig die specifiek zijn voor de gemodificeerde eiwit.
Opleiding
Het kan een uitdaging zijn om een Western-blot correct uit te voeren en goede resultaten te krijgen, dus het personeel moet goed opgeleid zijn. In dit en bij veel andere dingen is ervaring misschien wel de beste leermeester; zelfs voor een ervaren technicus is een Western-blot echter tijdrovend. Het gelelektroforese-gedeelte van het experiment, bijvoorbeeld, zal typisch één tot twee uur duren om uit te voeren. Andere taken kunnen natuurlijk worden uitgevoerd terwijl de gel loopt, maar het experiment duurt nog behoorlijk wat tijd om resultaten te krijgen.
Andere beperkingen
Antilichamen kunnen soms enige off-target binding vertonen, wat tot slechtere resultaten kan leiden. Bovendien gebruik je bij Western blotting een antilichaam tegen een specifiek eiwit, dus je resultaten zullen je alleen vertellen of dat eiwit aanwezig was. Massaspectrometrie met hoge resolutie onthult daarentegen alle eiwitten die in een monster aanwezig zijn, en in tegenstelling tot klassieke Western-blotting is het kwantitatief. Het is natuurlijk belangrijk om te onthouden dat massaspectrometrie veel duurder is en ook technisch uitdagender om te gebruiken in vergelijking met Western-blotting.