De genetische blauwdruk van een cel is gecodeerd in het genetische materiaal of DNA. Omdat het DNA de celkern nooit verlaat, zodat deze informatie in het cytoplasma kan komen waar andere eiwitten en biochemische componenten aanwezig zijn, is het noodzakelijk om eerst het DNA te transcriberen in messenger RNA (mRNA of poly (A) RNA). Dit mRNA wordt vervolgens vertaald in eiwitten die veel functies van de cel vervullen. Om zeer zeldzame mRNA's te detecteren of te kwantificeren, probes voor microarrays te maken of bibliotheken van complementaire DNA-moleculen te construeren, moet mRNA worden geïsoleerd. Totale RNA-extractie (d.w.z. al het RNA in een cel) en daaropvolgende mRNA-isolatie sluiten elkaar echter niet uit; de eerste moet worden uitgevoerd om mRNA te kunnen extraheren.
TRIzol-homogenisatie: Totaal RNA omvat alle mRNA, transfer-RNA, ribosomaal RNA en andere niet-coderende RNA's. Om deze van andere cellulaire componenten te scheiden, wordt de cel eerst opengebarsten om zijn inhoud. Dit wordt gedaan door cellen die zijn gepelleteerd door centrifugeren (spinnen met hoge snelheden) opnieuw te suspenderen in TRIzol-reagens (Life Technologies). Andere versies van TRIzol (zoals Ambion's TRI-reagens) werken op dezelfde manier.
Totale RNA-isolatie: een reeks centrifugaties wordt gebruikt om de verschillende componenten (eiwitten, DNA, RNA) van de cel in lagen of fasen in de suspensie te scheiden. De bovenste, geelgekleurde fase bestaat uit vet en kan worden weggegooid. De gewenste fase is rood getint, bevat het totale RNA en blijft behouden. Na het uitvoeren van een fenol-chloroform-extractie en een reeks alcoholwassingen met isopropanol en ethanol, kan het RNA worden gepelleteerd voor mRNA-isolatie. Voeg RNase-remmers toe om te voorkomen dat dit enzym het totale RNA afbreekt.
mRNA-extractie: het is gebruikelijk om een kit te gebruiken om mRNA's te isoleren, omdat zelfgemaakte laboratoriumprotocollen geen grote hoeveelheden genereren van zeer gezuiverde mRNA's. Commerciële kits bevatten Invitrogen's FastTrack 2.0 of Ambion's Poly (A)Pure mRNA-isolatie Kit. Deze basisstappen zijn gebruikelijk voor dergelijke kits:
d) Centrifugeer dit monster en win het supernatant, dat meerdere keren wordt gewassen in een reeks bindende en zoutarme buffers die in de kits worden geleverd.
Referenties
- "cDNA-bibliotheekprotocollen?"; Ian G. Cowell en Caroline A. Austin; 1997
- "In vitro transcriptie- en vertaalprotocollen?"; Martijn J. tymmen; 1995
Tips
- Houd alle reagentia, cellen en RNA koud door onder te dompelen in ijs. Dit voorkomt dat het RNA wordt afgebroken door andere enzymen die vrijkomen tijdens het homogenisatieproces.
Waarschuwingen
- Reagentia zoals TRIzol zijn giftig en mogen niet in contact komen met de huid of slijmvliezen. Neem altijd veilige laboratoriumprotocollen in acht bij het hanteren van dit reagens.
Over de auteur
Palmer Owyoung heeft een Master of Arts in internationaal zakendoen behaald aan de University of California in San Diego en een Bachelor of Arts in sociologie van de University of California in Santa Barbara en is een getrainde moleculaire bioloog. Sinds 2006 is hij freelance schrijver. Naast schrijven is hij fulltime Forex-handelaar en internetmarketeer.
Fotocredits
Jupiterimages/Photos.com/Getty Images