Bij het werken met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) is een goede kalibratie absoluut essentieel om betrouwbare resultaten van hoge kwaliteit te garanderen. Een goede kalibratie van een HPLC-instrument begint met het maken van een geschikte kalibratiestandaard. In de meeste gevallen vereist kalibratie in feite een reeks standaarden van toenemende concentratie om een zogenaamde kalibratiecurve te produceren. Dit is een uitgezette lijn en bijbehorende vergelijking die de relatie beschrijft tussen de concentratie van de chemische stof waarop wordt getest en de respons van de HPLC-detector.
Bepaal de chemische stof die u wilt testen voor het gebruik van de HPLC (de "analyt"). U kunt bijvoorbeeld een reeks frisdranken testen op het fructosegehalte, in welk geval fructose de analyt zou zijn.
Verkrijg een hoeveelheid van de analytchemicaliën van geschikte zuiverheid. Normaal gesproken moet de zuiverheid hoger zijn dan 99% en moet de analyt worden gekocht bij een gerenommeerd chemisch toeleveringsbedrijf. In het geval van fructose zou je bijvoorbeeld pure fructose kopen bij een chemische verkoper en niet bij een supermarkt.
Bepaal de maximale en minimale verwachte concentraties van de analyt in de monsters die u op de HPLC wilt testen. In het geval van frisdranken zou u de etiketten van de dranken onderzoeken en het laagste en hoogste fructosegehalte bepalen van de dranken die u gaat testen. Houd er rekening mee dat het initiële monster (de frisdrank) kan worden verdund of anderszins kan worden gemanipuleerd tijdens de voorbereiding voor analyse (afhankelijk van de gebruikte HPLC-methode) en dus kan de analytconcentratie in de monsters die daadwerkelijk op de HPLC worden geïnjecteerd, gewijzigd. Het is de analytconcentratie in de monsters zoals uitgevoerd op de HPLC waarmee rekening moet worden gehouden.
Bepaal het oplosmiddel waarin u uw analyt wilt oplossen om kalibratiestandaarden op te stellen. Dit oplosmiddel moet de analyt goed kunnen oplossen over een relatief breed concentratiebereik (minstens zo hoog als in de monsters die u wilt testen). Ook zou dit oplosmiddel idealiter vrij gelijkaardig moeten zijn aan de "mobiele fase": het oplosmiddel dat wordt gebruikt om monsters door het HPLC-instrument te voeren.
Bereken de hoeveelheid analyt die nodig is om een "standaard"-oplossing van de analyt te maken. Dit wordt gevonden door de vereiste concentratie van de voorraadstandaard te vermenigvuldigen met het gewenste volume. De concentratie van de analyt in deze oplossing moet ten minste 10% hoger zijn dan de hoogst verwachte monsterconcentratie. Als de hoogst verwachte fructoseconcentratie in een frisdrankmonster 8 gram/100 milliliter is, dan zou de voorraadstandaard op een concentratie van 10 gram fructose/100 milliliter kunnen worden gezet. Een redelijk volume is 500 milliliter, dus 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fructose zou nodig zijn.
Weeg de benodigde hoeveelheid analyt af tot een geschikt niveau van precisie. Vaak is een gewichtswaarde in gram nauwkeurig tot op één of twee decimalen geschikt, maar voor sommige methoden kan meer precisie nodig zijn.
Breng de gewogen analyt over in een maatkolf van het benodigde volume en voeg het gewenste oplosmiddel toe aan de vulmarkering op de kolf. Het gebruik van een maatkolf (in plaats van bijvoorbeeld een maatbeker) verhoogt de nauwkeurigheid van de standaardconcentratiewaarde van de voorraad. Zorg ervoor dat alle analyt wordt overgebracht naar de kolf; gebruik indien nodig wat van het oplosmiddel om het in te wassen.
Maak een reeks variërende verdunningen van de voorraadstandaard door bekende volumes van de voorraadstandaard over te brengen in maatkolven, met behulp van pipetten voor nauwkeurige overdracht en vervolgens oplosmiddel toe te voegen. De laagste standaardconcentratie moet lager zijn dan het laagst verwachte monster dat moet worden geanalyseerd. Als in het frisdrankvoorbeeld de laagste verwachte fructoseconcentratie in een monster 2 gram/100 ml is, dan zou een standaard van 1 gram/100 ml kunnen worden gemaakt. Dit zou worden bereikt door een tienvoudige verdunning van de voorraadstandaard. De standaardreeks zou in totaal 5 of 6 concentraties moeten bevatten, dus aanvullende verdunningen om normen van misschien 3, 5 en 8 gram fructose/ml te produceren, zouden nodig zijn. U hebt nu een reeks standaardoplossingen waarmee u de HPLC kunt kalibreren.