Hogedrukvloeistofchromatografie is een techniek voor de laboratoriumanalyse van een mengsel. Het is een efficiënt type chromatografie dat gebruik maakt van hoge druk, in plaats van alleen de zwaartekracht, om een monster van een mengsel door een kolom te stuwen. Een monster wordt geïnjecteerd, waarna een pomp met hoge druk helpt om het monster langs een gepakte kolom te verplaatsen, waar het in afzonderlijke componenten wordt gescheiden. Deze scheiding wordt vervolgens geanalyseerd door een detector om resultaten op te leveren.
Injectieplaats
Om in een HPLC te worden geïnjecteerd, moet een monster eerst worden opgelost in een polair vloeibaar oplosmiddel, bij voorkeur een met bekende HPLC-spectra, zodat de gegevens ervan kunnen worden onderscheiden van die van het monster. De vloeibare oplossing die het monster bevat, wordt in het instrument geplaatst en in de kolom gestuurd. De werkelijke locatie van de injectieplaats is afhankelijk van het merk instrumenten. In de meeste gevallen is het injectieproces geautomatiseerd, maar in sommige gevallen moet een laboratoriummedewerker het monster injecteren met een kleine injectienaald.
Pomponderdeel
De pompcomponent van de HPLC-eenheid is nodig omdat deze de druk levert die het monster door de kolom voortstuwt. De kracht van de pomp varieert, maar een krachtige pomp kan een druk tot 6.000 psi of pond per vierkante inch produceren, die wordt toegepast nadat het monster is geïnjecteerd. Hierdoor kan het monster sneller en efficiënter door de kolom gaan dan wanneer het alleen door de zwaartekracht zou druppelen.
Kolombeschrijving
De verhoogde snelheid van een monster dat door een pomp door de kolom wordt gevoerd, maakt het gebruik van een ander type kolom mogelijk dan die welke bij eenvoudige vloeistofchromatografie worden gebruikt. Het pakkingsmateriaal in de kolom kan een veel kleinere deeltjesgrootte hebben, wat het oppervlak vergroot en daardoor de interacties van het monster met de kolom bevordert. De meeste HPLC-kolommen werken via polariteit. Het monster wordt opgelost in een polair oplosmiddel en de kolom bestaat grotendeels uit niet-polaire koolwaterstoffen. De polaire delen van het monstermolecuul gaan zeer snel door de kolom omdat ze voornamelijk in wisselwerking staan met de oplosmiddel, terwijl de niet-polaire componenten van het monster in de kolom blijven hangen en zwakke interacties met de kolom vormen componenten. Daarom komen de componenten van het monster uit de kolom in volgorde van meest polair tot meest niet-polair.
Detectorfunctie:
Detectoren variëren ook op basis van het type HPLC-instrument dat wordt gebruikt. De meeste functioneren echter op dezelfde basismanier. Een bron van ultraviolet licht schijnt op de gescheiden monstercomponenten wanneer ze van de kolom komen. De meeste organische verbindingen absorberen een bepaalde hoeveelheid licht, dus als ze de toegepaste lichtstraal passeren, kan een detector detecteren hoeveel licht er wordt geabsorbeerd. De detector registreert ook de retentietijd van de componenten op basis van de volgorde waarin ze van de kolom komen. Deze output kan vervolgens worden geanalyseerd op basis van het piekoppervlak om de exacte aard van de componenten van het monster te bepalen.