Gēla elektroforēze ir parasti izmantota laboratorijas tehnika ar daudziem praktiskiem pielietojumiem, ieskaitot DNS pirkstu nospiedumu noņemšanu un genoma sekvencēšanu. Process ietver atdalīšanu DNS fragmenti, izmantojot elektrisko strāvu, vienlaikus izsekojot molekulārās kustības ātrumam caur filtrēšanas želeju.
Pievienojot zilu vai oranžu izsekošanas krāsu bezkrāsainiem DNS paraugiem, jūs varat redzēt savu paraugu un iegūt informāciju par to, kā DNS molekulas pārvietojas elektroforēzes laikā. Identifikācija ir balstīta uz DNS joslu lielumu uz gela pēc molekulu migrācijas.
Kā darbojas gēla elektroforēze
Gēla elektroforēze izvelk DNS fragmentus caur gēlu, izmantojot elektrisko strāvu, lai izolētu un identificētu DNS molekulas pēc lieluma un elektriskā lādiņa. Gelu bieži izgatavo ar agarozes pulveris - polisaharīds, kas iegūts no jūraszāles.
Agarozi pievieno ūdens un sāls buferšķīdumam, un maisījumu karsē un atdzesē, lai iegūtu porainu gēlu, kas elektroforēzes procedūras laikā darbosies kā filtrējošā matrica. Pēc tam gēlu ievieto elektroforēzes vienībā un pārklāj ar buferšķīdumu, kas vada
elektrība.Šķīdumus, kas satur DNS, un piesātinošās krāsvielas, pipetē gēla mazās iedobēs, kas jāizgatavo gēla sagatavošanas laikā. Krāsvielaspalīdzēt tevskaidri redzēt izlasi ka jūs pievienojat gēla iedobēm, kas atrodas netālu no elektroforēzes vienības negatīvā elektroda.
Pozitīvs elektrods atrodas pretējā galā. Pirmajā iedobē ievieto zināmu DNS fragmentu standartu, kas salīdzināšanas un identifikācijas nolūkos izveidos DNS joslu kāpnes.
DNS molekulu fosfāta mugurkauls dod DNS negatīvu lādiņu. Pretstati pievilina, tāpēc DNS molekulas tiek piesaistītas pozitīvajam elektrodam, un, ieslēdzot elektrisko strāvu, tās sāk kustēties vai “migrēt”.
Mazāka izmēra DNS fragmenti pārvietojas ātrāk nekā lielāki fragmenti, jo migrējot pa želejas poraino matricu, viņiem rodas mazāka pretestība. Līdzīga izmēra DNS fragmenti veido DNS joslas gēlā.
Krāsas nolādēšanas mērķis un nozīme
DNS ir bezkrāsains, tāpēc pievienojot izsekošanas krāsvielas pēc parauga jums palīdz nosaka kustības ātrumu dažāda lieluma olbaltumvielu molekulas gēlā elektroforēzes laikā. Krāsu ielādes piemēri, kas pārvietojas ar DNS paraugu, ietver bromfenolszils un ksilola cianols.
Izvēlētajai krāsai nevajadzētu būt reaktīvai vai mainīt DNS. Bromfenola zils ir krāsviela, ko izmanto, lai izsekotu mazāka izmēra DNS virknes, kas satur apmēram 400 bāzes pārus, savukārt ksilola cianols ir labāks lielākiem DNS pavedieniem ar līdz pat 8000 bāzes pāriem. Izvēlētajai krāsai nevajadzētu būt reaktīvai vai mainīt DNS.
Glicerīna loma agarozes gēla elektroforēzē
Gatavojot DNS paraugu elektroforēze, jums būs jāpievieno glicerīns un ūdens kopā ar krāsvielām. Glicerīns ir smaga, sīrupaina viela, kas piešķir DNS paraugam lielāku blīvumu, pirms to ievieto akās gēla loksnes vienā galā.
Bez glicerīna DNS paraugs izkliedētos, nevis iegrimtu un urbumā izveidotu slāni, kā tas paredzēts, lai izveidotu DNS kāpnes.
Krāsu izsekošana SDS PAGE
Nātrija dodecilsulfāta poliakrilamīda gēla elektroforēze (SDS PAGE) ir metode, kas piemērota olbaltumvielu un aminoskābju atdalīšanai, kas ir mazākas un sarežģītākas nekā lineārās DNS molekulas. Elektroforēzei agarozes gēla vietā izmanto poliakrilamīdu (SDS PAGE gēlu).
Bromfenola zilu (BPB) pievieno parauga buferim kā a izsekošanas krāsviela kas pārvietojas vienā un tajā pašā proteīnu atdalīšanas virzienā un norobežo to priekšējo malu.
DNS saistošās krāsas loma
DNS saistoša krāsa, piemēram, oranžas krāsas etīdija bromīdu var pievienot gēlam vai elektroforēzes buferim. Kā norāda nosaukums, krāsa pievienojas DNS molekulai.
Rīkojoties ar šo mutagēno krāsu, jābūt ļoti uzmanīgam, jo tas var saistīties ar DNS ādas šūnās. Atšķirībā no izsekošanas krāsvielām, etidija bromīds fluorescē spilgti zem UV gaisma, padarot DNS joslas redzamas.