Western Blot priekšrocības un trūkumi

Western blot, analītisks paņēmiens, ko izmanto, lai noteiktu konkrētu olbaltumvielu dotajā paraugā, izmanto fermenta vai ar fluorescenci iezīmētas primārās antivielas spēju saistīties ar tās specifisko antigēnu. Tas ir trīspakāpju process, kas sākas ar gēla elektroforēzi, kam seko membrānas blotēšana un zondēšana ar antivielām. Olbaltumvielu noteikšana var būt tieša vai netieša, pēdējai izmantojot marķētas sekundāras antivielas, kas vērstas pret primāro. Lai gan Western blot tiek pieņemts kā ikdienas olbaltumvielu analīzes paņēmiens, tam ir ierobežojumi, kā arī priekšrocības.

Viens no lielākajiem argumentiem par labu Western blot ir tā jutīgums. Tā kā tā spēj noteikt paraugā tikai 0,1 nanogramu olbaltumvielu, teorētiski šī metode var kalpot kā efektīvs agrīnās diagnostikas rīks, kas pacientam izjūt pat vismazāko vīrusa vai baktēriju imunogēno reakciju paraugs. Netiešais rietumu blots turpina balstīties uz šo jutīgumu no sekundāro antivielu spējas pastiprināt attēlveidošanas sistēmas noteiktā signāla intensitāti. Lielāka jutība nozīmē, ka testēšanai ir nepieciešams mazāk antivielu, kas ievērojami samazina laboratorijas izmaksas.

Western blot metode ir specifiska diviem galvenajiem faktoriem. Pirmkārt, ar gēla elektroforēzi paraugs tiek sakārtots dažāda lieluma, lādiņa un konformācijas olbaltumvielās. Šis process pats par sevi ir milzīgs solis ceļā uz noteikšanu, jo želejā izveidotās joslas jau dod norādes par interesējošā proteīna vai polipeptīda lielumu. Antivielu un antigēnu mijiedarbības specifika kalpo kā otrais lielais faktors. Tā kā specifiskās antivielas parāda afinitāti pret specifiskiem proteīniem, process var selektīvi noteikt mērķa proteīnu pat 300 000 dažādu olbaltumvielu maisījumā.

Neskatoties uz jutīgumu un specifiskumu, Western blot joprojām var radīt kļūdainus rezultātus. Nepatiesi pozitīvi rezultāti, ja antiviela reaģē ar neparedzētu olbaltumvielu, kas ir bieži notiek, ja pacientam, kuram tiek veikta HIV pārbaude, ir tuberkuloze vai vairāki parazīti infekcijas. Savukārt kļūdaini negatīvs rezultāts var būt viegli, ja lielākiem proteīniem netiek dots pietiekami daudz laika, lai tie pareizi pārietu uz membrānu. Nepareiza blotēšana un apstrāde bieži rada šķības, izbalējušas vai pat vairākas joslas, testu rezultātus pakļaujot tehniķa interpretācijai.

Western blot izmaksas ir lielu individuālo izdevumu kopums par marķētām antivielām, kvalificētiem analītiķiem un laboratorijas aprīkojumu. Smalkam procesam, rietumu blotēšanai, ir vajadzīga precizitāte katrā solī, lai pareizi identificētu parauga sastāvdaļas. Neliela kļūda reaģenta koncentrācijā vai inkubācijas periodā var būt katastrofāla visā procesā. Visbeidzot, noteikšanai un attēlveidošanai nepieciešamais aprīkojums - ķīmiluminiscences, fluorescējošas, radioaktīvas vai lāzera noteikšanas sistēmas - vidējai mikrobioloģijas vienībai var būt pārāk dārgs.