Polimerāzes ķēdes reakcija jeb PCR ir paņēmiens, kas vienu DNS fragmentu fotokopē daudzos fragmentos - eksponenciāli daudzos. Pirmais solis ir PĶR ir DNS sasildīšana tā, lai tā denaturētu vai izkustu atsevišķos pavedienos. DNS struktūra ir kā virvju kāpnes, kurās pakāpieni ir troses ar magnētiskiem galiem. Magnēti savienojas, veidojot pakāpienus, sauktus par bāzes pāriem, un tādējādi pretojas tam, ka tos izvelk. Katrs DNS fragments dažādās temperatūrās kūst atsevišķos pavedienos. Izpratne par to, kā DNS struktūru tur kopā ar atsevišķām DNS daļām, sniegs ieskatu, kāpēc dažādi DNS fragmenti izkausē dažādās temperatūrās un kāpēc vispirms ir vajadzīgas tik augstas temperatūras vieta.
Kūst! Kūst!
Pirmais PĶR solis ir DNS izkausēšana tā, lai divķēdes DNS atdalītos vienpavediena DNS. Zīdītāju DNS šis pirmais solis parasti ietver aptuveni 95 grādu pēc Celsija (aptuveni 200 Fārenheita) siltumu. Šajā temperatūrā ūdeņraža saites starp A-T un G-C bāzu pāriem vai pakāpieniem DNS kāpnēs sadalās, atraisot dubultās DNS. Tomēr temperatūra nav pietiekami karsta, lai salauztu fosfāta-cukura mugurkaulu, kas veido atsevišķus pavedienus vai kāpņu stabus. Pilnīga atsevišķu virkņu atdalīšana sagatavo tos PCR otrajam posmam, kas atdziest, ļaujot īsiem DNS fragmentiem, ko sauc par grunts, saistīt atsevišķos pavedienus.
Magnētiski rāvējslēdzēji
Viens no iemesliem, kāpēc DNS tiek uzkarsēts līdz augstajai temperatūrai 95 grādiem pēc Celsija, ir tas, ka jo garāka ir DNS dubultā virkne, jo vairāk tā vēlas palikt kopā. DNS garums ir viens faktors, kas ietekmē kušanas temperatūru, kas izvēlēta PCR uz šī DNS gabala. A-T un G-C bāzu pāri divkāršās DNS saitē viens ar otru, lai kopā turētu dubultās dzīslas struktūru. Jo vairāk secīgu bāzes pāru ir savienojušies starp diviem viengabalainiem pavedieniem, jo vairāk arī viņu kaimiņi vēlas sasaistīties, un jo spēcīgāka kļūst pievilcība starp abiem pavedieniem. Tas ir kā rāvējslēdzējs, kas izgatavots no maziem magnētiem. Aizverot rāvējslēdzēju, magnēti, protams, vēlēsies rāvējslēdzēju un paliks rāvējslēdzēji.
Spēcīgāki magnēti pielīp stingrāk
Vēl viens faktors, kas ietekmē kušanas temperatūru, lai izvēlētos jūsu interesējošo DNS fragmentu, ir šajā fragmentā esošo G-C bāzes pāru daudzums. Katrs bāzes pāris ir kā divi mini magnēti, kas piesaista. Pāris, kas izgatavots no G un C, ir daudz spēcīgāk piesaistīts nekā A un T pāris. Tādējādi DNS gabalam, kurā ir vairāk G-C pāru nekā citam fragmentam, pirms izkausēšanas atsevišķos pavedienos būs nepieciešama augstāka temperatūra. DNS dabiski absorbē ultravioleto gaismu - precīzāk, ar 260 nanometru viļņa garumu -, un vienvirziena DNS absorbē vairāk gaismas nekā divkāršu DNS. Tātad absorbētās gaismas daudzuma mērīšana ir veids, kā izmērīt, cik daudz jūsu divšķiedru DNS ir izkusis atsevišķos pavedienos. G-C un A-T bāzes pāru "magnētiskā rāvējslēdzēja" ietekme ir tas, kas izraisa gaismas absorbcijas grafiku divkāršota DNS, kas pret temperatūras paaugstināšanos ir attēlota kā sigmoidāla, veidota kā S, nevis a taisne. S līkne atspoguļo komandas darba pretestību, ko bāzes pāri izturas pret karstumu, jo viņi nevēlas nošķirt.
Pusceļa punkts
Temperatūru, kurā DNS garums kūst atsevišķos pavedienos, sauc par tās kušanas temperatūru, ko apzīmē ar saīsinājumu “Tm”. Tas norāda temperatūru, kurā puse DNS šķīdumā ir izkususi atsevišķos pavedienos, bet otra puse joprojām ir divkāršu formā. Kušanas temperatūra katram DNS fragmentam ir atšķirīga. Zīdītāju DNS G-C saturs ir 40%, tas nozīmē, ka atlikušie 60% bāzes pāru ir As un Ts. Tā 40% G-C saturs izraisa zīdītāju DNS izkausēšanu 87 grādos pēc Celsija (aptuveni 189 pēc Fārenheita). Tāpēc zīdītāju DNS pirmais PĶR solis ir tās uzsildīšana līdz 94 grādiem pēc Celsija (201 Fārenheita). Tikai septiņus grādus karstāks par kušanas temperatūru, un visi dubultie pavedieni pilnībā izkusīs līdz atsevišķiem pavedieniem.