Saskaņā ar Viskonsinas Universitātes BioWeb tīmekļa vietni, PCR primer ir īss, sintētisks oligonukleotīds (parasti no 18 līdz 25 bāzēm garš), ko izmanto, lai pastiprinātu noteiktus DNS reģionus molekulārās bioloģijas tehnikā, kas pazīstama kā polimerāzes ķēdes reakcija (PCR). Gan uz priekšu, gan atpakaļgaitā esošie grunts ir nepieciešami, lai tie būtu DNS ķēdes reversie papildinājumi, lai sānos un saistītos ar vēlamo DNS reģionu. Kad zinātnieki vēlas veikt pētījumus par noteiktu gēnu vai DNS reģionu, viņiem vispirms jāveic PCR, lai iegūtu pietiekami daudz mērķa reģiona, ar kuru strādāt. Vajadzīga nepieciešamība veidot grunts sekvences interesējošajam reģionam, ja tās jau nav pieejamas, izmantojot iepriekš publicētus pētījumus vai ar komerciāliem līdzekļiem.
Iegūstiet interesējošā gēna vai DNS reģiona nukleotīdu secību un izlemiet, cik ilgi fragmentu vēlaties pastiprināt. Uz priekšu un atpakaļ virzošais grunts ir paredzēts saistīšanai vēlamā fragmenta sākumā un beigās. Parasti parastajās PĶR metodēs tiek izmantoti gruntskrāsas, kas sānu malā ir no 100 līdz 1000 bāzes pāri, savukārt reālā laika PĶR metodēs tiek izmantoti fragmenti, kuru garums ir aptuveni 50 līdz 200 bāzes.
Izlemiet, kur secībā vēlaties, lai primeri gulētu. Piemēram, jūs varētu vēlēties atrašanās vietu netālu no secības 5 'vai 3' beigām vai vidū. Ja vēlaties, norādiet grunts vietu, lai aptvertu intronu.
Dizaina grunti ir no 18 līdz 24 bāzēm. Vincents R. Prezidento, Ph. D., no Brinkmann Instruments Inc., ierosina, ka šis garums ir pietiekami garš, lai tas būtu ārkārtīgi specifisks vēlamajam DNS reģionam, bet pietiekami īss, lai viegli saistītos (atlaidinātu). Gruntēšanas kušanas temperatūrai (Tm) jābūt no 55 līdz 80 grādiem pēc Celsija, pietiekami zemai, lai varētu pilnībā izkausēt 90 grādos pēc Celsija vai virs tās, bet pietiekami augstai, lai ļautu atlaidināt. GC saturam (Gs un Cs procentuālajai daļai secībā) jābūt no 40 līdz 60 procentiem. Lai veicinātu saistīšanos, grunts sekvences 3 'galam jābeidzas ar C vai G (ko sauc par GC skavu), jo G un C nukleotīdiem ir stiprākas saites, tomēr secības pēdējās piecās bāzēs jāizvairās no trim vai vairāk G vai Cs.
Izvairieties no četru vai vairāk vienas bāzes (piemēram, ACCCC ...) vai četru vai vairāku di-nukleotīdu atkārtojumu (piemēram, ATATATAT ...), jo tie var izraisīt nepareizu apgriešanu. Dizaina grunti bez intra-primer homoloģijas (vairāk nekā trīs bāzes, kas papildina vienu pašu primeru) vai starpgruntu homoloģiju (kur uz priekšu un atpakaļ virzošajam grunts ir papildinošs secības). Tas var izraisīt pašdimērus vai primer-dimērus, kur grunti saistās ar sevi, nevis saistās ar vēlamo DNS secību.
Izmantojiet tiešsaistes resursus un vietnes, kas palīdz veidot gruntskrāsas vai palīdz pārbaudīt grunts sekvences pašpietiekamību vai potenciālu veidot sekundāras struktūras, piemēram, matadatas. Dažās gruntēšanas dizaina vietnēs ir Masačūsetsas Tehnoloģiskā institūta Primer3, Nacionālā biotehnoloģijas informācijas centra Primer-Blast un Integrēto DNS tehnoloģiju OligoAnalyzer.
