Western Blotting trūkumi

Western blotēšana ir viena no visbiežāk izmantotajām procedūrām bioķīmiskās laboratorijās. Būtībā tas atdala olbaltumvielas no parauga pēc lieluma, pēc tam testē, izmantojot antivielas, lai noteiktu, vai konkrētais proteīns ir klāt. Tas ir noderīgi ne tikai pētījumos, bet arī medicīnas vai diagnostikas laboratorijās; gan HIV, gan Laima slimības testi ietver, piemēram, ar enzīmiem saistītu imūnsorbentu testu (ELISA) testu, kam seko Western blot, ja ELISA tests ir pozitīvs. Neskatoties uz popularitāti, rietumu blotēšanai ir vairāki trūkumi.

Klasiskie rietumu bloti nav kvantitatīvi. Citiem vārdiem sakot, lai arī viņi var pateikt pētniekiem, vai konkrēts proteīns ir klāt, tie neļauj kvantitatīvi noteikt, cik daudz olbaltumvielu ir klāt. Daži biotehnoloģiju uzņēmumi tagad pārdod komplektus, kas ļauj pētniekiem vai laboratorijas tehniķiem noteikt to daudzumu olbaltumvielu klātbūtne, izmantojot standarta līkni, bet tas darbojas tikai tad, ja ir tīri tā paša proteīna paraugi pieejams. Turklāt olbaltumvielu molekulmasu var noteikt tikai ar Western blotēšanu, nevis precīzi noteikt kā ar masu spektrometriju.

Western blot var veikt tikai tad, ja ir pieejamas primārās antivielas pret interesējošo olbaltumvielu. Lai gan antivielas pret daudziem dažādiem olbaltumvielām ir pieejamas biotehnoloģiju uzņēmumos, tās nav lētas; ja primāras antivielas nav pieejamas konkrētam proteīnam, nebūs iespējams veikt Western blot, meklējot tieši šo olbaltumvielu. Turklāt pētnieki varētu vēlēties noteikt, vai olbaltumviela ir kaut kādā veidā modificēta - ja tā ir fosforilēta (tai bija: fosfāta grupa, kas tam pievienota), piemēram - un ar Western blot tehniku ​​viņiem nepieciešamas modificētajām specifiskas antivielas olbaltumvielas.

Pareizi veikt Western blot un gūt labus rezultātus var būt sarežģīti, tāpēc personālam jābūt labi apmācītam. Šajā, tāpat kā citur, pieredze, iespējams, ir labākais pasniedzējs; pat pieredzējušam tehniķim tomēr Western blot ir laikietilpīgs. Piemēram, eksperimenta gēla elektroforēzes daļa parasti ilgst no vienas līdz divām stundām. Citus uzdevumus, protams, var veikt, kamēr gels darbojas, taču eksperimentam joprojām vajadzīgs diezgan ilgs laiks, lai iegūtu rezultātus.

Antivielām dažreiz var būt saistība ārpus mērķa, kas var radīt sliktākus rezultātus. Turklāt, veicot Western blotēšanu, jūs izmantojat antivielu pret noteiktu olbaltumvielu, tāpēc jūsu rezultāti jums pateiks tikai tad, ja šis proteīns bija klāt. Turpretī augstas izšķirtspējas masas spektrometrija atklāj visus paraugā esošos proteīnus, un atšķirībā no klasiskās rietumu blotēšanas tā ir kvantitatīva. Protams, ir svarīgi atcerēties, ka masu spektrometrija ir daudz dārgāka un arī tehniski sarežģītāka, salīdzinot ar Western blotēšanu.