Šūnas ģenētiskais projekts ir kodēts tā ģenētiskajā materiālā jeb DNS. Tā kā DNS nekad neatstāj šūnas kodolu, lai šī informācija nonāktu citoplazmā, kur citi olbaltumvielu un bioķīmisko komponentu klātbūtne, vispirms ir nepieciešams DNS transkribēt Messenger RNS (mRNS vai poli (A) RNS). Tad šī mRNS tiek pārveidota par olbaltumvielām, kas veic daudzas šūnas funkcijas. Lai atklātu vai kvantitatīvi izteiktu ļoti retas mRNS, izveidotu zondes mikrouzņēmumiem vai izveidotu komplementāru DNS molekulu bibliotēkas, mRNS ir jāizolē. Tomēr kopējā RNS (t.i. visas RNS šūnā) ekstrakcija un turpmākā mRNS izolēšana nav savstarpēji izslēdzoši procesi; pirmais ir jāveic, lai varētu izdalīt mRNS.
TRIzola homogenizācija: kopējā RNS ietver visu mRNS, pārneses RNS, ribosomu RNS un citus nekodētus RNS. Lai tos atdalītu no citiem šūnu komponentiem, šūna vispirms tiek atvērta, lai to atbrīvotu saturs. To veic, atkārtoti suspendējot šūnas, kas granulētas, centrifugējot (vērpjot ar lielu ātrumu) TRIzol Reagent (Life Technologies). Arī citas TRIzol versijas (piemēram, Ambion’s TRI Reagent) darbojas līdzīgi.
Kopējā RNS izolēšana: Centrifugēšanas sēriju izmanto, lai šūnas dažādos komponentus (olbaltumvielas, DNS, RNS) sadalītu suspensijās vai fāzēs. Augšējā, dzeltenās krāsas fāze sastāv no taukiem, un to var izmest. Vēlamā fāze ir tonēta sarkanā krāsā, satur kopējo RNS un tiek saglabāta. Pēc fenola-hloroforma ekstrakcijas un spirta mazgāšanas sērijas, izmantojot izopropanolu un etanolu, RNS var granulēt mRNS izolēšanai. Pievienojiet RNāzes inhibitorus, lai šis ferments nesadalītu kopējo RNS.
mRNS ekstrakcija: Parasti tiek izmantots komplekts, lai izolētu mRNS, jo mājās gatavoti laboratorijas protokoli nerada lielu daudzumu ļoti attīrītu mRNS. Komerciālajos komplektos ietilpst Invitrogen's FastTrack 2.0 vai Ambion's Poly (A) Pure mRNS izolācija Komplekts. Šādiem komplektiem ir kopīgas šādas pamata darbības:
d) Centrifugē šo paraugu un iegūst supernatantu, ko vairākas reizes mazgā virknē saistošo un mazsāls buferšķīdumu, kas paredzēti komplektos.
Atsauces
- "cDNA bibliotēkas protokoli?"; Īans G. Kauels un Kerolīna A. Ostina; 1997
- "In vitro transkripcijas un tulkošanas protokoli?"; Mārtiņš Dž. Timma; 1995
Padomi
- Uzturiet visus reaģentus, šūnas un RNS auksti, iegremdējot ledū. Tas novērš RNS noārdīšanos ar citiem fermentiem, kas atbrīvojas homogenizācijas procesā.
Brīdinājumi
- Reaģenti, piemēram, TRIzol, ir toksiski un nedrīkst nonākt saskarē ar ādu vai gļotādām. Strādājot ar šo reaģentu, vienmēr ievērojiet drošus laboratorijas protokolus.
par autoru
Palmer Owyoung ir ieguvis mākslas maģistra grādu starptautiskajā biznesā Kalifornijas universitātē Sandjego un a Mākslas bakalaurs socioloģijā Kalifornijas Universitātē Santa Barbarā un ir apmācīts molekulārs biologs. Kopš 2006. gada viņš ir ārštata rakstnieks. Papildus rakstīšanai viņš ir pilna laika Forex tirgotājs un interneta tirgotājs.
Foto kredīti
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images