Bioķīmiķi un molekulārie biologi izmanto elektroforēzi, lai atdalītu makromolekulas, piemēram, olbaltumvielas un nukleīnskābes. Tas ļauj zinātniekiem izolēt un analizēt atsevišķus proteīnus vai nukleīnskābes secības sarežģītā maisījumā. Tipisks elektroforēzes piemērs laboratorijā ir mikrobiologs, kurš izmanto polimerāzes ķēdes reakciju (PCR), lai atdalītu mikrobu kopienā radušos DNS fragmentus. Neatkarīgi no mērķa elektroforēzei vienmēr ir nepieciešams izmantot buferšķīdumu.
TL; DR (pārāk ilgi; Nelasīju)
Elektroforēze atdala makromolekulas, piemēram, olbaltumvielas un nukleīnskābes, pēc lieluma, lādiņa un citām īpašībām. Elektroforēzei, kas atdalās ar lādiņu, zinātnieki izmanto buferi, lai pārsūtītu šo lādiņu caur gēlu. Buferis arī uztur gēlu pie stabila pH, līdz minimumam samazinot izmaiņas, kas varētu notikt olbaltumvielā vai nukleīnskābē, ja to pakļautu nestabilam pH.
Elektroforēzes principi
Elektroforēze molekulas atdala pa gradientu, pamatojoties uz to lielumu, lādiņu vai citām īpašībām. Šis gradients var būt elektriskais lauks vai, denaturējošas gradienta gēla elektroforēzes (DGGE) gadījumā, denaturants, piemēram, urīnvielas un formamīda maisījums. Olbaltumvielas migrēs uz anodu, ja lādiņš būs negatīvs, un katodu, ja lādiņš būs pozitīvs. Tā kā lielākas molekulas migrē lēnāk nekā mazākas, zinātnieki var izmērīt nobraukto attālumu un izmantot logaritmus, lai noteiktu fragmentu lielumu.
Denaturējoša gradienta gēla elektroforēze
Izmantojot DGGE, DNS pārvietojas pa pieaugoša denaturēšanas spēka gradientu, līdz spēks ir pietiekams, lai pilnībā denaturētu vai izvērstu šo konkrēto DNS fragmentu. Šajā brīdī migrācija apstājas. Zinātnieki var izmantot šo metodi, lai atdalītu fragmentus, pamatojoties uz to individuālo uzņēmību pret denaturēšanu.
Ko dara buferis
Elektroforēzes gadījumā, kas atdalās, pamatojoties uz lādiņu, buferšķīdumā esošie joni pārraida atdalīšanai nepieciešamo lādiņu. Buferis, nodrošinot vājas skābes un bāzes rezervuāru, arī saglabā pH šaurā diapazonā. Tas ir svarīgi, jo olbaltumvielu vai nukleīnskābju struktūra un lādiņš mainīsies, ja tiks pakļautas ievērojamām pH izmaiņām, tādējādi novēršot pareizu atdalīšanos.
Tipiski buferi
Dažādi buferi ir ideāli piemēroti elektroforēzes gela uzturēšanai dažādos vēlamos pH diapazonos. Tipiski buferi, ko zinātnieki izmanto šim nolūkam, ir etiķskābe, borskābe, fosforskābe un citronskābe, kā arī glicīns un taurīns. Parasti pKa vērtībai (skābes disociācijas konstante) jābūt tuvu vajadzīgajam pH. Mums ir vēlams buferi, kas nodrošina mazu uzlādes pakāpi, lai nevadītu pārāk daudz strāvas.