Nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēze (SDS-PAGE) ir bioķīmiska metode olbaltumvielu identificēšanai šķīdumā. Kā parādīja Mathews et al. "Bioķīmijā", olbaltumvielu paraugus vispirms ieliek "akās" vai caurumos vienā poliakrilamīda gēla bloka galā. Pēc tam uz želejas tiek uzklāts elektriskais lauks. SDS, kas pievienots ielādētajiem paraugiem, negatīvi ietekmē olbaltumvielu dabisko lādiņu. Šī iemesla dēļ tikai olbaltumvielu molekulmasa nosaka olbaltumvielu migrācijas ātrumu, tām virzoties pa gēlu pozitīvi uzlādētā pola virzienā, atzīmē Bitesize Bio. Vairāki proteīni vienā un tajā pašā paraugā tādējādi atdalīsies viens no otra un migrēs uz dažādām pozīcijām.
Orientējiet gēla fotogrāfiju. "Augšdaļa" ir aku vieta, kur sākotnēji tika pievienoti paraugi. "Apakšdaļa" ir vieta, kur paraugi migrēja virzienā un visbiežāk satur krāsvielu fronti, kas norāda paraugu migrējošo priekšpusi. Vai nu kreisajā, vai labajā pusē jābūt "marķierim", ko izmanto kā paredzamu molekulmasas vadlīniju.
Marķējiet paraugus katrai joslai. Visā augšpusē akām pievienotie paraugi būs vertikāli pārvietojušies pa "joslām". Tāpēc visas vertikālajā kolonnā redzamās joslas radās no viena parauga, kas ielādēts tieši virs tā. Izmantojiet lineālu un pildspalvu, lai uzliktu robežas joslām, ja kolonnas ir grūti vizualizēt.
Marķiera joslā iezīmējiet joslu molekulāros izmērus. Komerciāli pieejamie marķieri ir sagaidāmi ar joslas modeļa attēlu, kā arī katras joslas molekulmasu. Joslas ir tumši horizontāli "stieņi", kas faktiski ir iekrāsoti proteīni, kas iestrādāti želejā.
Zīmējiet vieglas horizontālas līnijas, kas iziet no katras marķiera joslas līdz gēla pretējai malai. Esiet piesardzīgs, lai šīs līnijas būtu paralēlas akām un krāsvielu priekšpusei. Šīs līnijas norāda, kur katrā joslā atrastos olbaltumvielas ar molekulmasu, ko norāda katra marķiera josla. Piemēram, josla 4. joslā, kas atrodas tieši zem līnijas, kas pagarināta no 25 kilodaltona marķieru josla liecina, ka 4. joslas josla molekulāri ir gandrīz, bet ne gluži 25 kilodaltoni svars.
Marķējiet katru joslu katrā joslā ar paredzamo molekulmasu. Izmantojiet marķierus kā orientieri un novērtējiet vērtības starp marķieru izmēriem.
Zem gēla fotogrāfijas izveidojiet katras joslas "olbaltumvielu" sarakstu. Sākumā norādiet, kas ir zināms par katru paraugu, piemēram, tā izcelsmi vai apstākļus. Tad uzskaitiet aprēķināto katras joslas molekulāro svaru joslā. Joslas ar vienu joslu norāda, ka paraugā ir tikai viens proteīns. Joslas ar vairākām joslām norāda uz vairāku olbaltumvielu klātbūtni. Joslas, kas darbojas ar migrācijas fronti, ir mazākas, nekā ieteica tuvākais marķieris, un, visticamāk, tās nevar paredzēt, izņemot gadījumus, kad marķieris norāda "mazāku nekā".
Olbaltumvielu sarakstā atzīmējiet dīvainības. "Iesmērēts" izskats var norādīt, ka ir pārāk daudz olbaltumvielu vai parauga viskozitāte ietekmēja tā migrāciju. Ja šķiet, ka joslas pārsniedz joslas malas vai ir diezgan lielas, salīdzinot ar citām joslām, šī proteīna koncentrācija, visticamāk, ir pārāk augsta, un nākotnē tā jāatšķaida elektroforēze. Pelēks nokrāsa visā joslā, tumšāka nekā fona želejas krāsa, norāda uz neatšķiramiem olbaltumvielu fragmentiem.
Nosakiet olbaltumvielu identitāti katrā joslā. Lai gan tas tiek darīts, izmantojot tikai molekulmasu, katra joslas avots, visticamāk, norāda arī uz norādēm. Apsveriet, ka dažos apstākļos olbaltumvielas var uzturēt dimēra vai trimera asociāciju uz gela. Tādēļ viens proteīns uz gēla var parādīties kā trīs atšķirīgas joslas. Pat ja olbaltumvielas nevar identificēt, saišu relatīvais tumšums var norādīt uz olbaltumvielu koncentrāciju šķīdumā. Jebkurus ziņkārīgus un nezināmus proteīnus var izolēt tieši no oriģinālā gēla un nosūtīt identificēšanai.
Jums nepieciešamās lietas
- Krāsota SDS-PAGE gēla fotogrāfija
- Izmantotā molekulmasas marķiera atslēga
- Lineāls
- Pildspalva