Kas yra užšalimo lūžimas ir kodėl jis naudingas ląstelių biologijoje?

Ląstelių membranos susideda iš fosfolipidų ir prijungtų ar įterptų baltymų. Membraniniai baltymai vaidina gyvybiškai svarbų vaidmenį ląstelės metabolizme ir gyvenime. Negalite naudoti įprastos mikroskopijos, kad vizualizuotumėte ar apibūdintumėte sukibimo baltymus, transportuojančius baltymus ir baltymų kanalus ląstelės membranoje. Naudojant elektroninę mikroskopiją ir metodą, vadinamą „užšalimo lūžiu“, kuris padalija sušalusias ląstelių membranas, leidžia vizualizuoti membranos struktūrą ir baltymų organizaciją Jūros jūroje fosfolipidai. Kitų metodų derinimas su užšaldytu lūžinėjimu ne tik padeda mums suprasti skirtingų ląstelių membranų struktūrą ir membranos baltymų, tačiau leidžia vizualizuoti ir išsamiai išanalizuoti specifinių baltymų, bakterijų ir virusai.

Naudojant skystą azotą, biologiniai audinių mėginiai ar ląstelės greitai užšaldomi, kad būtų imobilizuotos ląstelių sudedamosios dalys. Ląstelių membranos susideda iš dviejų fosfolipidų sluoksnių, vadinamų dvisluoksniais, kur hidrofobinės arba vandens nekenčiančios lipidų uodegos rodo į membranos vidus ir hidrofiliniai, arba vandenį mėgstantys, lipidų molekulės galai nukreipti į išorę ir link ląstelė. Užšaldytas mėginys įtrūkęs arba suskaidytas mikrotomu, kuris yra į peilį panašus instrumentas, skirtas pjaustyti plonus audinio gabalėlius. Dėl to ląstelių membrana skyla tiksliai tarp dviejų sluoksnių, nes trauka tarp hidrofobinių lipidų uodegų yra silpniausia vieta. Po suskaidymo mėginiui atliekama vakuuminė procedūra, vadinama „užšaldymo ofortu“. Lūžusio paviršiaus mėginys yra užtamsintas anglies ir platinos garais, kad būtų sukurta stabili kopija, kuri atitiktų lūžio kontūrus lėktuvas. Rūgštis naudojama virškinti organinę medžiagą, prilipusią prie replikos, paliekant ploną platinos apvalkalą iš suskaidyto membranos paviršiaus. Tada šis apvalkalas analizuojamas elektronine mikroskopija.

Ledinis ėsdinimas yra nefiksuoto, užšaldyto ir užšaldyto biologinio mėginio vakuuminis džiovinimas. Džiovinimas vakuuminiu būdu yra panašus į vaisių ir daržovių, supakuotų ir parduodamų maisto prekių parduotuvėse, džiovinimą užšaldant. Be užšaldymo oforto, ledo kristalai užgožia daugelį ląstelių struktūros detalių. Giluminio ar užšaldymo ėsdinimo etapas pagerina ir pratęsia pradinį užšalimo lūžio metodą, leidžiantį stebėti ląstelių membranas atliekant įvairias veiklas. Tai leidžia analizuoti ne tik membranos struktūrą, bet ir tarpląstelinius komponentus ir pateikia išsamią struktūrinę informaciją apie bakterijas, virusus ir stambiuosius ląstelinius baltymus kompleksai.

Elektroninė mikroskopija gali atskleisti ir padidinti daugiau nei milijoną kartų mažiausius organizmus ar struktūras, tokias kaip bakterijos, virusai, tarpląsteliniai komponentai ir net baltymai. Vizualizacija sukuriama bombarduojant ypač ploną mėginį elektronų pluoštu. Du elektroninės mikroskopijos metodai yra skenuojančioji elektroninė mikroskopija arba SEM ir perdavimo elektroninė mikroskopija arba TEM. Užšalimo lūžių mėginiai reguliariai analizuojami naudojant TEM. TEM yra geresnė nei SEM skiriamoji geba ir siūlo struktūrinę informaciją iki 3 nanometrų kopijų.

Užšaldyto lūžio elektroninės mikroskopijos sukūrimas ir naudojimas parodė, kad ląstelių plazmos membranos susideda iš lipidų dvigubų sluoksnių ir paaiškino, kaip baltymai organizuojami ląstelių membranose. Užšalęs lūžis suteikia unikalų vaizdą į ląstelių membranų vidų, nes jis padalija ir atskiria membranos fosfolipidus į du priešingus ir vienas kitą papildančius lakštus ar paviršius. Per daugiau nei 50 metų nuo pirmojo užšalimo lūžių aparato pristatymo platinos kopijos darymas vis dar yra vienintelis būdas gauti struktūrinę informaciją apie ląstelės membraną. Technika parodo, ar specifiniai baltymai plūduriuoja, ar yra įtvirtinti ląstelės membranoje, ir ar kai kurie baltymai kaupiasi. Naujesnis metodas - naudojant antikūnus, nukreiptus į specifinius baltymus - derinamas su užšalimo lūžiu, siekiant nustatyti baltymus ir jų funkciją ląstelės membranoje.