DNR
Dezoksiribonukleino rūgštis ir baltymai. DNR yra suskirstyta į vienetus, vadinamus genais, kurių kiekvienas koduoja tam tikrą RNR ar baltymų seką. Genai tiriami siekiant sužinoti apie biologinę struktūrą ir funkciją, evoliuciją, ligas ir daugelį kitų gyvosios sistemos aspektų. Norint išsamiai ištirti genus, DNR turi būti išskirta ir išgryninta iš dominančių ląstelių.
DNR išskyrimas
Nors DNR iš vienos ląstelės galima išgauti ir ištirti, to nepakanka pamatyti plika akimi. Norėdami gauti kiekį, kurio pakaks susukti, tuo daugiau langelių turite dirbti, tuo geriau (daugybė milijonų).
Tikslūs protokolai labai skiriasi, atsižvelgiant į unikalias konkrečių mėginių savybes, tačiau bendrieji žingsniai yra homogenizavimas, lizavimas, suardymas, atskyrimas ir surinkimas. Procedūrą geriausia atlikti mažame (priklausomai nuo mėginio dydžio) stikliniame arba plastikiniame vamzdelyje.
Mėginys paprastai sumaišomas arba sumalamas, kad ląstelės būtų kruopščiai atskiriamos viena nuo kitos. Tai daro ląstelių sudedamąsias dalis lengviau pasiekiamas paskesniems reagentams. Po to į homogenatą pridedama ploviklio ar fermentų, kad lizuotų ląstelių membranos (ir branduolinės membranos, jei ląstelės yra eukariotinės), kad išlaisvintų DNR. Šiuo metu DNR supa baltymai, lipidai, angliavandeniai ir visa kita, kas buvo ląstelėse.
Norint suskaidyti baltymus, gali prireikti papildomo fermentinio virškinimo, kad jie nesijungtų su DNR ir netrukdytų ją rinkti. DNR atskiriama nuo likusio ląstelės turinio pridedant šalto, gryno, etilo arba izopropilo alkoholio. DNR netirpsta šiuose alkoholiuose, todėl ji kondensuosis bandydama kuo labiau sumažinti sąlytį su alkoholiu. Tada surenkamos sutirštintos DNR, paprastai centrifuguojant arba sukant.
DNR sukimas
DNR surinkimas sukant yra efektyvus, kai ekstrahavimo būdu gaunamas didelis kiekis DNR. Tai taip pat puikus demonstravimo metodas, nes aiškiai matomas įspūdingas grynos DNR raizginys.
Norint sukti DNR, atskyrimo žingsnis turi būti atliekamas atsargiai. Jei tai nebuvo anksčiau pridėto lizės reagento mišinio dalis, prieš alkoholio įpylimą į tirpalą reikia įpilti koncentruoto druskos tirpalo (natrio chlorido). Šaltas alkoholis lėtai pilamas į mėgintuvėlio šoną, kad susidarytų sluoksnis ant vandeninio tirpalo, vengiant maišymo. Jei bus padaryta teisingai, alkoholis ant druskingo sluoksnio sudarys savo sluoksnį. Tada ateina ritė.
Norėdami surinkti DNR iš sūraus sluoksnio, atsargiai uždėkite stiklinę maišymo lazdelę alkoholio sluoksniu, kol ji liečia mėgintuvėlio dugną. Lėtai sukite strypą tarp pirštų, stebėdami sąsają tarp dviejų sluoksnių. Jei yra pakankamai DNR, ji susikaupia sąsajoje tarp sluoksnių, kad susidarytų pieno permatoma masė. Sukite lazdelę, kad apvyniotumėte DNR aplink ją (tai yra ritinė dalis), ir ištraukite ją iš mėgintuvėlio. DNR gali būti perkelta į kitą mėgintuvėlį gryno alkoholio, kad būtų galima laikyti ar atlikti tolesnę analizę.
