DNR klonavimas: apibrėžimas, procesas, pavyzdžiai

Klonuoti galima visus organizmus, tokius kaip avis Dolly, tačiau DNR klonavimas yra kitoks. Gamyboje naudojama molekulinės biologijos technika identiškos DNR sekų ar pavienių genų kopijos.

Naudojant genų inžinerijos metodus, nustatomi ir išskiriami DNR genetinio kodo segmentai. Tada DNR klonavimas nukopijuoja nukleino rūgštis sekos segmentuose.

Gautas identiškas kopijas galima panaudoti tolesniems tyrimams arba biotechnologijoms. Dažnai nukopijuojamas genas koduoja baltymą, kuris gali būti medicininio gydymo dalis. DNR technologija, įskaitant DNR klonavimas remia suvokimą, kaip veikia genai ir kaip žmogaus genetinis kodas veikia kūno funkcionavimą.

DNR klonavimas yra molekulinės biologijos procesas, padarant identiškas DNR segmentų, esančių chromosomose, kuriose yra pažangių organizmų genetinis kodas, kopijas.

Procesas sukuria didelius kiekius tikslinės DNR sekos. DNR klonavimo tikslas yra pačių tikslinių DNR sekų gamyba arba baltymų, užkoduotų tikslinėse sekose, gamyba.

Yra vadinami du DNR klonavimui naudojami metodai plazmidės vektorius ir polimerazės grandininė reakcija (PGR). Viduje konors plazmidės vektorius metodu, DNR grandinės supjaustomos naudojant restrikcijos fermentai DNR fragmentams gaminti, o susidarę segmentai įterpiami į klonavimo vektorius, vadinamus plazmidėmis, kad būtų galima pakartoti toliau. Plazmidės dedamos į bakterijų ląsteles, kurios vėliau gamina DNR kopijas arba užkoduotus baltymus.

Viduje konors PGR metodas, DNR grandinių segmentas, kurį reikia dubliuoti, yra pažymėtas fermentais, vadinamais gruntai. Polimerazės fermentas daro žymimos DNR grandinės dalies kopijas. Šis metodas nenaudoja restrikcijos fermentų ir gali pagaminti klonuotą DNR iš mažų mėginių. Kartais abu DNR technologijos metodai naudojami kartu, kad į bendrą reakciją būtų įtrauktos geriausios kiekvieno iš jų savybės.

Metodo vektorius reiškia plazmidę, naudojamą klonuotam tiksliniam DNR segmentui laikyti. Plazmidės yra mažos apskritos sruogos ne chromosomų DNR randama daugelyje organizmų, įskaitant bakterijas ir virusus.

Bakterinės plazmidės yra vektorius, naudojamas tikslinio DNR segmento įterpimui į bakterijų ląsteles tolesniam dubliavimuisi.

Tikslinės DNR pasirinkimas ir išskyrimas: Prieš pradedant DNR klonavimo procesą, reikia nustatyti DNR sekas, ypač DNR segmentų pradžią ir galus.

Tokias DNR sekas galima rasti naudojant esamą klonuotą DNR su žinomomis sekomis arba tiriant baltymą, kurį gamina tikslinė DNR seka. Kai seka yra žinoma, gali būti naudojami atitinkami restrikcijos fermentai.

Tikslinės DNR pjaustymas restrikcijos fermentais: Ribojimo fermentai parenkami siekiant ieškoti DNR kodo tikslinių sekų pradžioje ir pabaigoje.

Kai restrikcijos fermentai randa specialią koduotą bazių porų seką, vadinamą restrikcijos vietomis, jie prisitvirtinti prie DNR toje vietoje ir apvynioti aplink DNR molekulę, atskiriant sruoga. Iškirptus DNR segmentus, kuriuose yra tikslinė seka, dabar galima dubliuoti.

Plazmidės vektoriaus pasirinkimas ir tikslinės DNR įterpimas: Tinkamoje plazmidėje idealiai yra tos pačios DNR koduojančios sekos kaip ir DNR grandinėje, iš kurios buvo nukirsta tikslinė DNR. Apskritinė plazmidės DNR grandinė supjaustoma tais pačiais restrikcijos fermentais, kurie buvo naudojami tikslinei DNR.

A DNR ligazės fermentas yra naudojamas skatinti DNR segmentų susiejimą, o tikslinio DNR segmento galai susiejami su nukirptais plazmidės DNR galais. Tikslinė DNR dabar sudaro žiedinės plazmidės DNR grandinės dalį.

Įterpiant plazmidę į bakterijų ląstelę: Kai plazmidėje yra DNR seka, kuri bus klonuojama, tikrasis klonavimas gali vykti naudojant procesą, vadinamą bakterijų transformacija. Plazmidės įterpiamos į bakterijų ląstelę, pvz., E. coli, o ląstelės su naujais DNR segmentais pradės gaminti kopijas ir atitinkamus baltymus.

Bakterijų transformacijos metu ląstelės šeimininkės ir plazmidės inkubuojamos kartu kūno temperatūroje apie 12 valandų. Ląstelės absorbuoja dalį plazmidžių ir traktuoja jas kaip savo plazmidinę DNR.

Klonuotų DNR ir baltymų rinkimas: Dauguma plazmidžių, naudojamų DNR klonavimui, turi atsparumo antibiotikams genai įtraukti į jų DNR. Kai bakterijų ląstelės absorbuoja naujas plazmides, jos tampa atsparios antibiotikams.

Kai kultūra apdorojama antibiotikais, išgyvena tik tos ląstelės, kurios absorbavo naujas plazmides. Rezultatas - gryna bakterijų ląstelių kultūra su klonuota DNR. Tuomet galima surinkti tą DNR arba pagaminti atitinkamą baltymą.

The PGR metodas yra paprastesnis ir nukopijuoja esamą DNR vietoje. Tam nereikia pjaustyti restrikcijos fermentais ar įterpti plazmidėDNR sekos. Tai ypač tinka klonuoti DNR mėginius su ribotu DNR grandinių skaičiumi. Nors metodas gali klonuoti DNR, jis negali būti naudojamas atitinkamo baltymo gamybai.

Atvyniokite DNR grandines: DNR chromosomose yra sandariai suvyniota dvigubos spiralės struktūroje. DNR kaitinimas iki 96 laipsnių Celsijaus vadinamuoju procesu denatūracija priverčia DNR molekulę susisukti ir atsiskirti į dvi sruogas. Šis atskyrimas reikalingas, nes vienu metu galima klonuoti tik vieną DNR grandinę.

Gruntų pasirinkimas: Kaip ir plazmidės vektoriaus DNR klonavimo atveju, klonuojamos DNR sekos turi būti identifikuojamos, ypatingą dėmesį skiriant DNR segmentų pradžiai ir galams. Pradmenys yra fermentai, kurie prisijungia prie specifinių DNR kodo sekų, ir juos reikia parinkti, kad būtų galima pažymėti tikslinius DNR segmentus. Tinkami pradmenys prisitvirtins prie DNR molekulių sekų, kad pažymėtų tikslinių segmentų pradžią ir galus.

Reakcijos, susijusios su pradmenimis, atkaitinimas Vadinamas reakcijos atvėsinimas iki maždaug 55 laipsnių Celsijaus atkaitinimas. Atvėsus reakcijai, pradmenys suaktyvėja ir prisitvirtina prie DNR grandinės kiekviename tikslinio DNR segmento gale. Pradmenys veikia tik kaip žymekliai, o DNR grandinės nereikia perpjauti.

Gaminti identiškas tikslinio DNR segmento kopijas: Procese vadinamas pratęsimas, į reakciją pridedamas karščiui jautrus TAQ polimerazės fermentas. Tada reakcija įkaitinama iki 72 laipsnių Celsijaus, suaktyvinant fermentą. Aktyvus DNR polimerazės fermentas prisijungia prie pradmenų ir nukopijuoja tarp jų DNR seką. Pradinis DNR sekos nustatymo ir klonavimo procesas yra baigtas.

Klonuotų DNR derlingumo padidinimas: Pradinis atkaitinimo ir pratęsimo procesas sukuria palyginti nedaug turimų DNR grandinės segmentų kopijų. Norint padidinti derlių per papildomą DNR replikaciją, reakcija vėl atšaldoma, kad vėl suaktyvintų pradmenis ir leistų jiems prisijungti prie kitų DNR grandinių.

Tada pakartotinai kaitinant reakciją, vėl suaktyvinamas polimerazės fermentas ir gaunama daugiau kopijų. Šis ciklas gali būti kartojamas nuo 25 iki 30 kartų.

Plazmidės vektoriaus metodas priklauso nuo gausaus pradinio DNR tiekimo, kad būtų galima supjaustyti ir įterpti į plazmides. Per mažai originalios DNR sukelia mažiau plazmidžių ir lėtai pradeda klonuoti DNR.

PGR metodas gali pagaminti didelį DNR kiekį iš kelių originalių DNR grandinių, tačiau kadangi DNR nėra implantuojama į bakterijų ląstelę, baltymų gamyba neįmanoma.

Norint gauti baltymą, užkoduotą DNR fragmentuose, kurie turi būti klonuojami iš mažo pradinio DNR mėginio, galima naudoti abu metodus ir jie gali papildo vienas kitą. Pirmiausia PGR metodas naudojamas DNR klonuoti iš mažo mėginio ir gauti daug kopijų.

Tada PGR produktai naudojami kartu su plazmidės vektoriaus metodu, norint pagamintą DNR implantuoti į bakterijų ląsteles, kurios gamins norimą baltymą.

Molekulinė biologija naudoja genų klonavimą ir DNR replikaciją medicinos ir komerciniais tikslais. Bakterijos su klonuotomis DNR sekomis naudojamos vaistams gaminti ir pakeisti medžiagoms, kurių genetinių sutrikimų turintys žmonės patys negali pasigaminti.

Tipiniai naudojimo būdai:

• Genas žmogaus insulino yra klonuojamas bakterijose, kurios gamina insuliną, kurį naudoja diabetikai.
• Audinių plazminogeno aktyvatorius gaminamas iš klonuotos DNR ir naudojamas padėti išvengti kraujo krešulių susidarymo.
• Žmogaus augimo hormonas gali būti gaminamas ir administruojamas žmonėms, kurie patys to negamina.

Biotechnologija taip pat naudoja genų klonavimą žemės ūkyje, kad sukurtų naujas augalų ir gyvūnų savybes arba sustiprintų esamas savybes. Kai klonuojama daugiau genų, galimų panaudojimų skaičius eksponentiškai auga.

DNR molekulės sudaro nedidelę medžiagos dalį gyvoje ląstelėje, ir sunku išskirti daugelio genų įtaką. DNR klonavimo metodais tyrimams tiekiamas didelis kiekis specifinės DNR sekos, o DNR gamina baltymus taip pat, kaip ir pirminėje ląstelėje. DNR klonavimas leidžia atskirai ištirti šią operaciją skirtingiems genams.

Tipiniai tyrimai ir DNR technologijos taikymas apima:

• Geno funkcija.
• Geno mutacijos.
• Genų išraiška.
• Genų produktai.
• Genetiniai defektai.

Kai klonuojama daugiau DNR sekų, lengviau surasti ir klonuoti papildomas sekas. Esami klonuoti DNR segmentai gali būti naudojami norint nustatyti, ar naujas segmentas atitinka senąjį ir kurios dalys skiriasi. Tuomet tikslinė DNR seka nustatoma greičiau ir tiksliau.

Į genų terapija, klonuotas genas pateikiamas organizmo, kurio natūralus genas yra pažeistas, ląstelėms. Gyvybiškai svarbus genas, gaminantis baltymą, reikalingą konkrečiai organizmo veiklai, gali būti mutuotas, pasikeitęs radiacija ar paveiktas virusų.

Kai genas neveikia tinkamai, ląstelėje trūksta svarbios medžiagos. Genų terapija bando pakeisti geną klonuotu variantu, kuris pagamins reikiamą medžiagą.

Genų terapija vis dar yra eksperimentinė, ir nedaugelis pacientų buvo išgydyti naudojant šią techniką. Problemos kyla nustatant vienintelį geną, atsakingą už sveikatos būklę, ir daugelio geno kopijų pristatymą į reikiamas ląsteles. DNR klonavimui plačiau paplitus, genų terapija buvo taikoma keliose konkrečiose situacijose.

Naujausios sėkmingos paraiškos buvo:

• Parkinsono liga: Naudojant virusą kaip vektorių, pacientų viduriniuose smegenyse buvo suleistas su Parkinsono liga susijęs genas. Pacientai patyrė geresnius motorinius įgūdžius be jokio neigiamo šalutinio poveikio.
• Adenozino deaminazės (ADA) trūkumas: Genetinis imuninis sutrikimas buvo gydomas pašalinant paciento kraujo kamienines ląsteles ir įterpiant ADA geną. Dėl to pacientai galėjo pagaminti bent dalį savo ADA.
• Hemofilija: Žmonės, sergantys hemofilija, negamina specifinių baltymų, kurie padeda kraujui krešėti. Vieno iš trūkstamų baltymų gamybos genas buvo įterptas į pacientų kepenų ląsteles. Pacientai gamino baltymus ir sumažėjo kraujavimo atvejų.

Genų terapija yra viena perspektyviausių DNR klonavimo programų, tačiau tikriausiai daugės kitų naujų panaudojimo būdų, nes tiriama daugiau DNR sekų ir nustatoma jų funkcija. DNR klonavimas suteikia genų inžinerijai reikalingą žaliavą tiek, kiek reikia.

Kai žinomas genų vaidmuo ir jų tinkamą funkciją galima užtikrinti pakeičiant defektus genai, daugybė lėtinių ligų ir net vėžys gali būti užpulti ir gydyti genetiniu lygiu naudojant DNR technologija.

Susijęs turinys:

• E.Coli (Escherichia Coli) kolonijos charakteristikos
• RNR: apibrėžimas, funkcija, struktūra