Gelio elektroforezė yra dažniausiai naudojama laboratorijos technika, pritaikyta daugybei praktikų, įskaitant DNR pirštų atspaudus ir genomo seką. Procesas apima atskyrimą DNR fragmentai, naudojantys elektros srovę stebėdami molekulinio judėjimo greitį per filtravimo gelį.
Pridedant mėlynos arba oranžinės spalvos sekimo dažų į bespalvius DNR mėginius, galėsite pamatyti savo mėginį ir gauti informacijos apie tai, kaip DNR molekulės juda elektroforezės metu. Identifikavimas yra pagrįstas DNR juostų dydžiu gelyje po molekulių migracijos.
Kaip veikia gelio elektroforezė
Gelio elektroforezė traukia DNR fragmentus per gelį naudodamas elektros srovę, kad išskirtų ir atpažintų DNR molekules pagal dydį ir elektrinį krūvį. Gelis dažnai gaminamas su agarozės milteliai - polisacharidas, išgautas iš jūros dumbliai.
Agarozė įpilama į buferinį vandens ir druskos tirpalą, mišinys kaitinamas ir atvėsinamas, kad gautųsi porėtas gelis, kuris elektroforezės procedūros metu veiks kaip filtravimo matrica. Tada gelis dedamas į elektroforezės įrenginį ir padengiamas laidžiu buferiniu tirpalu elektros.
Tirpalai, kuriuose yra DNR ir dažančiųjų dažiklių, pipetuojami į mažus gelio šulinius, kurie turi būti pagaminti gelio paruošimo metu. Dažikliaipadėti tauaiškiai matyti pavyzdį kad pridedate prie gelio šulinių, esančių šalia neigiamo elektroforezės įrenginio elektrodo.
Teigiamas elektrodas yra priešingame gale. Žinomas DNR fragmentų standartas dedamas į pirmąjį šulinį, kuris sukurs DNR juostų kopėčias palyginimo ir identifikavimo tikslais.
DNR molekulių fosfato pagrindas suteikia DNR neigiamą krūvį. Priešingybės traukia, todėl DNR molekulės pritraukia teigiamą elektrodą ir pradeda judėti arba „migruoti“, kai įjungiama elektros srovė.
Mažesnio dydžio DNR fragmentai keliauja greičiau nei didesni fragmentai, nes migruodami per poringą gelio matricą susiduria su mažesniu atsparumu. Panašaus dydžio DNR fragmentai gelyje sudaro DNR juostas.
Dažų paskirtis ir svarba
DNR yra bespalvė, todėl pridedama sekimo dažikliai pavyzdys jums padeda nustatyti judėjimo greitį skirtingų dydžių baltymų molekulių gelyje elektroforezės metu. Kraunančių dažiklių, judančių kartu su DNR mėginiu, pavyzdžiai yra bromfenolismėlyna ir ksileno cianolis.
Pasirinktas dažiklis neturėtų būti reaktyvus ar pakeisti DNR. Bromfenolio mėlynasis yra dažiklis, naudojamas mažesnio dydžio DNR grandinėms, kuriose yra apie 400 bazių porų, sekti, o ksileno cianolis geriau tinka didesnėms DNR grandinėms, turinčioms iki 8000 bazių porų. Pasirinktas dažiklis neturėtų būti reaktyvus ar pakeisti DNR.
Glicerolio vaidmuo agarozės gelio elektroforezėje
Ruošiant DNR mėginį elektroforezė, turėsite įpilti glicerolio ir vandens kartu su pakraunamaisiais dažais. Glicerolis yra sunki, sirupinė medžiaga, suteikianti daugiau tankio DNR mėginiui, prieš jį įterpiant į duobutes viename gelio lakšto gale.
Be glicerolio DNR mėginys pasiskirstytų, o ne grimztų ir formuotų šulinyje sluoksnį, kaip tai turėtų padaryti, kad susidarytų DNR kopėčios.
Dažų sekimas SDS PAGE
Elektroforezė natrio dodecilsulfato poliakrilamido geliu geliu (SDS PAGE) yra technika, tinkanti atskirti baltymus ir aminorūgštis, kurios yra mažesnės ir sudėtingesnės nei linijinės DNR molekulės. Elektroforezei vietoj agarozės gelio naudojamas poliakrilamidas (SDS PAGE gelis).
Bromfenolio mėlynasis (BPB) pridedamas prie mėginio buferio kaip a sekimo dažai kad juda ta pačia baltymų atskyrimo kryptimi ir riboja jų priekinį kraštą.
DNR surišančių dažų vaidmuo
DNR surišantys dažai, tokie kaip oranžinės spalvos etidio bromido galima pridėti į gelį arba į elektroforezės buferį. Kaip rodo pavadinimas, dažai prisijungia prie DNR molekulės.
Tvarkant šiuos mutageninius dažus reikia būti labai atsargiems, nes jie gali prisijungti prie DNR odos ląstelėse. Skirtingai nuo sekančių dažų, etidžio bromidas fluorescuoja ryškiai po UV spinduliai, todėl DNR juostos tampa matomos.