Western Blot privalumai ir trūkumai

„Western blot“ - analitinė technika, naudojama nustatyti konkretų baltymą tam tikrame mėginyje, naudoja fermento arba fluorescencija pažymėto pirminio antikūno gebėjimą prisijungti prie jo specifinio antigeno. Tai yra trijų etapų procesas, pradedant elektroforeze gelyje, po to atliekamas membranos blotavimas ir zondavimas antikūnais. Baltymų aptikimas gali būti tiesioginis ar netiesioginis, pastarajam naudojant žymėtą antrinį antikūną, nukreiptą prieš pirminį. Nors „Western blot“ pripažįstama kaip įprasta baltymų analizės technika, ji turi ir apribojimų, ir naudos.

Vienas iš didžiausių argumentų „Western blot“ naudai yra jo jautrumas. Dėl savo sugebėjimo aptikti vos 0,1 nanogramo baltymo mėginyje, teoriškai tai gali būti veiksminga ankstyvos diagnostikos priemonė, pajuntanti net menkiausią paciento viruso ar bakterijos imunogeninį atsaką pavyzdys. Netiesioginis „Western blot“ dar labiau remiasi šiuo jautrumu iš antrinių antikūnų gebėjimo sustiprinti vaizdo sistemos aptikto signalo intensyvumą. Didesnis jautrumas reiškia, kad tyrimams reikia mažiau antikūnų, o tai žymiai sumažina laboratorijos išlaidas.

Western blot technika savo specifiką turi dėl dviejų svarbių veiksnių. Pirma, gelio elektroforezė surūšiuoja mėginį į skirtingo dydžio, krūvio ir konformacijos baltymus. Šis procesas savaime yra didžiulis žingsnis aptikimo link, nes gelyje susiformavusios juostos jau suteikia užuominų apie dominančio baltymo ar polipeptido dydį. Antikūnų ir antigenų sąveikos specifiškumas yra antras didelis veiksnys. Kadangi specifiniai antikūnai rodo afinitetą specifiniams baltymams, procesas gali selektyviai aptikti tikslinį baltymą net 300 000 skirtingų baltymų mišinyje.

Nepaisant jautrumo ir specifiškumo, Western blot vis tiek gali duoti klaidingų rezultatų. Klaidingai teigiami rezultatai, kai antikūnas reaguoja su nenumatytais baltymais, o tai yra dažnai atsitinka, kai pacientas, kuriam atliekamas ŽIV tyrimas, serga tuberkulioze arba parazitiškai infekcijos. Kita vertus, klaidingai neigiamas rezultatas gali būti lengvas, jei didesniems baltymams nebus suteikta pakankamai laiko tinkamai pereiti į membraną. Netinkamas blotavimas ir apdorojimas dažnai sukelia iškreiptas, išblukusias ar net kelias juostas, todėl bandymų rezultatus gali interpretuoti technikas.

„Western blot“ kaina yra didelių individualių išlaidų žymėtiems antikūnams, kvalifikuotiems analitikams ir laboratorinei įrangai suma. Subtilus procesas, Western blotimas reikalauja tikslumo kiekviename etape, kad būtų galima tinkamai nustatyti mėginio sudedamąsias dalis. Nedidelė reagento koncentracijos ar inkubacijos laikotarpio paklaida gali būti pražūtinga visam procesui. Galiausiai aptikimui ir vaizdavimui reikalinga įranga - chemiliuminescencinės, fluorescencinės, radioaktyviosios ar lazerinės aptikimo sistemos - gali būti per brangi vidutiniam mikrobiologijos skyriui.