DNR sekos nustatymas: apibrėžimas, metodai, pavyzdžiai

Nukleotidai yra cheminiai gyvybės blokai ir yra gyvų organizmų DNR. Kiekvienas nukleotidas susideda iš cukraus, fosfatas ir a azoto turinti bazė: adeninas (A), timinas (T), citozinas (C) ir guaninas (G). Specifinė šių nukleotidų bazių tvarka nustato, kokius baltymus, fermentus ir molekules sintetins ląstelė.

Nukleotidų eilės arba sekos nustatymas yra svarbus tiriant mutacijos, evoliucija, ligos progresavimas, genetiniai tyrimai, teismo tyrimai ir medicina.

Genomika yra DNR, genų, genų sąveikos ir aplinkos įtakos genams tyrimas. Paslaptis, atskleidžianti sudėtingą vidinį genų veikimą, yra galimybė identifikuoti jų struktūrą ir vietą chromosomose.

Gyvų organizmų planą lemia DNR esančių nukleorūgščių bazių porų tvarka (arba seka). Kai DNR kartojasi, adeninas poruojasi su timinu, o citozinas - su guaninu; laikomos nesutampančios poros mutacijos.

Nuo dvigubos spiralės Deoksiribonukleorūgštis (DNR) molekulė buvo konceptualizuota 1953 m., Buvo padaryta dramatiškų patobulinimų genomikos ir didelio masto DNR sekos srityje. Mokslininkai uoliai stengiasi pritaikyti šias naujas žinias individualizuotam ligų gydymui.

Tuo pačiu metu vykstančios diskusijos leidžia mokslininkams neatsilikti nuo tokių greitai sprogstančių technologijų etinių pasekmių.

DNR sekos nustatymas yra įvairių nukleotidų bazių sekos atradimas DNR fragmentuose. Visų genų sekos leidžia palyginti chromosomas ir genomus, esančius tose pačiose ir skirtingose ​​rūšyse.

Chromosomų atvaizdavimas yra naudingas moksliniams tyrimams. Analizuojant sistemos mechanizmus ir struktūrą genai, aleliai ir DNR molekulių chromosomų mutacijos siūlo naujus genetinių sutrikimų gydymo būdus ir, pavyzdžiui, sustabdyti vėžinių navikų augimą.

Fredericko Sangerio DNR sekos nustatymo metodai aštuntajame dešimtmetyje labai išplėtojo genomikos sritį. Sangeris jautėsi pasirengęs spręsti DNR sekos nustatymą sėkmingai sekvenuodamas RNR tirdamas insuliną. Sangeris nebuvo pirmasis mokslininkas, užsiėmęs DNR sekos nustatymu. Tačiau jo sumanūs DNR sekos nustatymo metodai, sukurti kartu su kolegomis Bergu ir Gilbertu, 1980 m. Pelnė Nobelio premiją.

Sangeris žinojo galimą savo darbo vertę ir dažnai bendradarbiavo su kitais mokslininkais, kurie dalijosi jo interesais DNR, molekulinė biologija ir gyvybės mokslai.

Nors lėtas ir brangus, palyginti su šiandieninėmis sekvenavimo technologijomis, Sangerio DNR sekos nustatymo metodai tuo metu buvo giriami. Po bandymų ir klaidų Sangeris rado slaptą biocheminį „receptą“, kaip atskirti DNR sruogas, sukurti daugiau DNR ir nustatyti genome esančių nukleotidų eiliškumą.

Laboratorinių tyrimų metu galima lengvai įsigyti aukštos kokybės medžiagų:

• DNR polimerazė yra fermentas, reikalingas DNR gamybai.
• DNR pradmuo fermentui nurodo, nuo ko pradėti dirbti su DNR grandine.
• dNTP yra organinės molekulės, sudarytos iš dezoksiribozės cukraus ir nukleozidų trifosfatų - dATP, dGTP, dCTP ir dTTP - kurie surenka baltymus
• Grandinės galūnės yra dažų spalvos nukleotidai, dar vadinami terminatoriniais nukleotidais kiekvienai bazei - A, T, C ir G.

Sangeris sugalvojo, kaip naudojant DNR polimerazės fermentą suskaidyti DNR į mažus segmentus.

Tada jis pagamino daugiau DNR iš šablono ir į naująją DNR įterpė radioaktyviųjų atsekamųjų medžiagų, kad būtų galima atskirti atskirų gijų dalis. Jis taip pat pripažino, kad fermentui reikalingas gruntas, kuris galėtų prisijungti prie tam tikros šablono sruogos vietos. 1981 m. Sangeris vėl pateko į istoriją, išsiaiškindamas 16 000 bazinių porų mitochondrijų DNR genomą.

Temperatūra turi būti kruopščiai reguliuojama viso sekos nustatymo proceso metu. Pirmiausia chemikalai dedami į mėgintuvėlį ir kaitinami, kad išskaidytų (denatūruotų) dvigubą giją DNR molekulė. Tada temperatūra atvėsinama, leidžiant gruntui sukibti.

Toliau temperatūra pakeliama, kad būtų skatinamas optimalus DNR polimerazės (fermentų) aktyvumas.

Polimerazėje paprastai naudojami normalūs turimi nukleotidai, kurie pridedami didesne koncentracija. Kai polimerazė patenka į „grandinę baigiantį“ dažais susietą nukleotidą, polimerazė sustoja ir grandinė baigiasi ten, kas paaiškina, kodėl dažyti nukleotidai vadinami „grandinę baigiančiais“ arba „Terminatoriai“.

Procesas tęsiasi daug, daug kartų. Galiausiai su dažais susietas nukleotidas buvo dedamas į kiekvieną atskirą DNR sekos vietą. Gelio elektroforezė ir kompiuterinės programos gali identifikuoti dažų spalvas kiekvienoje DNR grandinėje ir išsiaiškinti visą DNR seką pagal dažus, dažų padėtį ir ilgį sruogos.

Didelio pralaidumo seka - paprastai vadinama naujos kartos sekos nustatymas - naudoja naujus pasiekimus ir technologijas, kad nukleotidų bazės būtų sekvenuojamos greičiau ir pigiau nei bet kada anksčiau. DNR sekos nustatymo aparatas gali lengvai valdyti didelės apimties DNR atkarpas. Tiesą sakant, visus genomus galima padaryti per kelias valandas, o ne metus naudojant Sangerio sekos metodus.

Naujos kartos sekvenavimo metodai gali atlikti didelės apimties DNR analizę be papildomo amplifikacijos ar klonavimo etapo, kad gautų pakankamai DNR sekvenavimui. DNR sekos nustatymo mašinos vienu metu vykdo kelias sekvenavimo reakcijas, o tai yra pigiau ir greičiau.

Iš esmės naujoji DNR sekvenavimo technologija vykdo šimtus „Sanger“ reakcijų ant mažo, lengvai įskaitomo lusto, kuris tada paleidžiamas per seką surenkančią kompiuterinę programą.

Ši technika nuskaito trumpesnius DNR fragmentus, tačiau vis tiek yra greitesnė ir efektyvesnė nei Sangerio sekos nustatymo metodai, todėl net ir didelio masto projektus galima greitai užbaigti.

The Žmogaus genomo projektas, baigtas 2003 m., yra vienas garsiausių iki šiol atliktų sekos tyrimų. Pagal 2018 m Mokslo naujienos, žmogaus genomas susideda iš maždaug 46.831 genai, kuris buvo didžiulis sekos iššūkis. Geriausi mokslininkai iš viso pasaulio bendradarbiaudami ir konsultuodami praleido beveik 10 metų. Vadovauja Nacionalinis žmogaus genomo tyrimas

Institutas, projektas sėkmingai atvaizdavo žmogaus genomą naudodamas bendrą anoniminių kraujo donorų paimtą mėginį.

Žmogaus genomo projektas rėmėsi bakterijų dirbtinių chromosomų (BAC pagrindu) sekos nustatymo metodais, kad suskirstytų bazių poras. Ši technika naudojo bakterijas DNR fragmentų klonavimui, todėl sekvenavimui buvo gautas didelis DNR kiekis. Tada klonų dydis buvo sumažintas, jie buvo įdėti į sekos nustatymo aparatą ir surenkami į žmogaus DNR vaizduojančius ruožus.

Nauji genomikos atradimai iš esmės keičia požiūrį į ligų prevenciją, aptikimą ir gydymą. Vyriausybė skyrė milijardus dolerių DNR tyrimams. Teisėsauga remiasi DNR analize, kad išspręstų bylas. DNR tyrimų rinkinius galima įsigyti namuose, kad būtų galima tirti protėvius ir nustatyti genų variantus, kurie gali kelti pavojų sveikatai:

• Genominė analizė reiškia daugelio skirtingų rūšių genomo sekų palyginimą ir kontrastavimą gyvenimo srityse ir karalystėse. DNR seka gali atskleisti genetinius modelius, kurie atskleidžia naują šviesą, kai tam tikros sekos buvo įvestos evoliuciškai. Kilmę ir migraciją galima atsekti atliekant DNR analizę ir palyginti su istoriniais įrašais.

• Medicinos pažanga vyksta eksponentiniu greičiu, nes praktiškai kiekviena žmogaus liga turi genetinį komponentą. DNR seka padeda mokslininkams ir gydytojams suprasti, kaip keli genai sąveikauja tarpusavyje ir su aplinka. Greitai sekvenuojant naujo mikrobo DNR, sukeliantį ligos protrūkį, gali būti lengviau nustatyti veiksmingus vaistus ir vakcinas, kol ši problema taps rimta visuomenės sveikatos problema. Genų variantai vėžinėse ląstelėse ir navikuose galėtų būti sekvenuoti ir panaudoti kuriant individualizuotą genų terapiją.

• Kriminalistika programos buvo naudojamos siekiant padėti teisėsaugai išaiškinti tūkstančius sunkių bylų nuo devintojo dešimtmečio pabaigos Nacionalinis teisingumo institutas. Nusikaltimo vietos įrodymuose gali būti kaulų, plaukų ar kūno audinių DNR pavyzdžių, kuriuos galima palyginti su įtariamojo DNR profiliu, kad būtų lengviau nustatyti kaltę ar nekaltumą. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra dažniausiai naudojamas būdas DNR kopijoms gaminti iš pėdsakų prieš seką.

• Naujai atrastų rūšių seka gali padėti nustatyti, kurios kitos rūšys yra artimiausios, ir atskleisti informaciją apie evoliuciją. Taksonomai naudoja DNR „brūkšninius kodus“ organizmams klasifikuoti. Pagal Džordžijos universitetas 2018 m. gegužę dar yra atrasta apie 303 žinduolių rūšys.

• Genetinis ligų tyrimas ieškokite mutavusių genų variantų. Dauguma yra pavienių nukleotidų polimorfizmai (SNP), o tai reiškia, kad tik vienas nukleotidas sekoje yra pakeistas iš „normalios“ versijos. Aplinkos veiksniai ir gyvenimo būdas turi įtakos tam tikrų genų ekspresijai. Pasaulinės kompanijos siūlo pažangiausias naujos kartos sekos nustatymo technologijas, prieinamas viso pasaulio tyrėjams, besidomintiems daugiakampio sąveika ir viso genomo sekvenavimu.

• Genealogijos DNR rinkiniai naudokite DNR sekas savo duomenų bazėje, kad patikrintumėte individo genų variantus. Komplektui reikalingas seilių mėginys arba skruostų tamponas, kuris išsiunčiamas į komercinę laboratoriją analizei atlikti. Be informacijos apie protėvius, kai kuriuose rinkiniuose galima identifikuoti pavienius nukleotidų polimorfizmus (SNP) ar kitus gerai žinomi genetiniai variantai, tokie kaip BRCA1 ir BRCA2 genai, susiję su padidėjusia moterų krūties rizika ir kiaušidžių vėžys.

Naujosios technologijos dažnai suteikia socialinės naudos ir žalos galimybę; pavyzdžiai apima netinkamai veikiančias atomines elektrines ir masinio naikinimo branduolinius ginklus. DNR technologijos taip pat kelia pavojų.

Emocinis susirūpinimas dėl DNR sekos nustatymo ir genų redagavimo įrankių, tokių kaip CRISPR, apima baimes, kad technologija gali palengvinti žmogaus klonavimą arba sukelti nesąžiningų gyvūnų sukurtus mutantinius transgeninius gyvūnus mokslininkas.

Dažniau etiniai klausimai, susiję su DNR sekos nustatymu, yra susiję su informuotu sutikimu. Lengva prieiga prie tiesioginio vartotojo DNR tyrimo reiškia, kad vartotojai gali ne iki galo suprasti, kaip bus naudojama, saugoma ir dalijamasi jų genetine informacija. Pasauliečiai gali būti emociškai nepasiruošę sužinoti apie savo ydingus genų variantus ir riziką sveikatai.

Trečiosios šalys, tokios kaip darbdaviai ir draudimo bendrovės, gali diskriminuoti asmenis, turinčius trūkumų turinčius genus, kurie gali sukelti rimtų medicininių problemų.