Tris arba tris (hidroksimetil) aminometanas yra įprastas biologinis buferis, naudojamas per visą DNR ekstrahavimo procesą. Ekstrahuojant iš bet kurio šaltinio, DNR yra jautri pH. Ląstelių lizės metu, pašalinant nepageidaujamus ląstelių komponentus ir nusodinant, stabiliam pH palaikymui naudojami tris. Be to, jis vaidina ypač svarbų vaidmenį ląstelių lizėje.
TL; DR (per ilgai; Neskaiciau)
DNR išskyrimas yra pH atžvilgiu jautrus procesas, o naudojant tris buferį, pH stabilus per ląstelių lizę ir ekstrahavimą.
Trisas kaip buferis
Kadangi pH gali turėti įtakos ir daugeliui ląstelių veiksnių, eksperimentiniam mokslui būtina išlaikyti stabilų pH. Biologiniai buferiai, kaip ir tris, yra svarbūs, nes jie gali išlaikyti stabilų pH, nepaisant įtakos, kuri kitaip gali pakeisti pH. Tris (hidroksimetil) aminometanas, kurio pKa yra 8,1, yra veiksmingas buferis, kurio pH yra nuo 7 iki 9. Dėl savo neutralaus diapazono tris yra dažniausiai naudojamas buferis biologinėse laboratorijose. Tačiau, kad būtų išvengta netikslumo, tris buferis yra jautrus temperatūrai ir turėtų būti naudojamas temperatūroje, kurioje jis buvo iš pradžių pH.
Ląstelių lizė
Lizė arba ląstelių pralaužimas yra pirmasis DNR išskyrimo žingsnis. Tai pasiekiama buferiu, kuriame yra tris ir EDTA (etilendiamintetraacto rūgštis). EDTA jungia dvivalentius katijonus, tokius kaip kalcis ir magnis. Kadangi šie jonai padeda palaikyti ląstelės membranos vientisumą, jų pašalinimas su EDTA destabilizuoja membraną. Tris yra pagrindinis buferinis komponentas; jo pagrindinis vaidmuo yra išlaikyti buferio pH stabiliame taške, paprastai 8,0. Be to, tris greičiausiai sąveikauja su membranoje esančiu LPS (lipopolisacharidu), padėdamas destabilizuoti membraną toliau.
Tris apsaugo DNR nuo pH pokyčių
Išardžius ląsteles, jų DNR ir turinys išsilieja į buferį. Be to, dažnai įtraukiama RNazė A (naikina RNR), proteazės (naikina baltymus) ir SDS (natrio dodecilsulfatas, soliubilizuoja membranos fragmentus). Kartu ši ląstelių turinio ir fragmentiškos RNR bei baltymų sriuba gali turėti didelę įtaką tirpalo pH. Kadangi DNR yra jautri pH, trims svarbu buferizuoti sriubą ir palaikyti pastovų pH.
DNR krituliai
Paskutiniame DNR ekstrahavimo etape iš tirpalo išgaunama pati DNR. Šiuo metu DNR tirpsta buferyje. Norint išgauti iš tirpalo, DNR tampa netirpi pridedant etanolio arba izopropanolio (izopropilo alkoholio). Tai padarius, DNR tirpale tampa akivaizdi kaip baltos spalvos mišinio medžiaga. Nors tokiu būdu DNR gali būti išskirta iš likusių ląstelių komponentų, netirpi ji nėra „tinkama naudoti“. Po išskyrimo alkoholis pašalinamas ir DNR turi būti grąžinta į biologinį buferį, pvz., Tris, kad būtų galima naudoti.
Pasidaryk pats
Nors DNR išskyrimas paprastai atliekamas tyrimų laboratorijose, paprastai naudojant vieną iš daugelio komerciškai prieinamų rinkinių, kiekvienas gali atlikti DNR išskyrimą namuose naudodamas įprastus namų apyvokos daiktus ir žalias žirniai ar špinatai. Šiuo atveju tris ir jokio biologinio buferio nėra, kad apsaugotų DNR nuo pH pokyčių. Tačiau tai yra vizualus būdas padėti studentams susisiekti su ląstelių DNR.
