Kaip DNR vizualizuojama naudojant gelinę elektroforezę?

Gelio elektroforezė yra technika, leidžianti analizuoti DNR jos sudedamųjų molekulių lygyje. Taikant šį DNR vizualizavimo metodą, mėginiai dedami ant agarozės gelio terpės ir ant gelio padedamas elektrinis laukas. Dėl to DNR fragmentai migruoja per gelį skirtingais greičiais, atsižvelgiant į jų elektrochemines savybes.

Etidžio bromidas

Šioje vizualizavimo technikoje etidžio bromidas sumaišomas su agarozės milteliais, EDTA buferiu ir vandeniu, kad prieš elektroforezę susidarytų gelio matrica. Dėl to etidžio bromido molekulės tolygiai išsisklaido po visą matricą. Užpildžius gelio duobutes atitinkamais DNR mėginiais ir sekančiais dažais, naudojama įtampa, kad dideli, poliniai junginiai lėtai ištrauktų matricą.

Šio judėjimo metu DNR molekulių pagrindai laikinai prisijungia prie dalelių dėl etidžio bromido krūvio, tempdami jas kartu. Kai bus baigta elektroforezė gelyje, kiekviena DNR molekulė pasiims nemažą kiekį etidžio bromido.

Esant ultravioletinei šviesai, etidžio bromidas pasižymi fluorescencija. Technikai per gelį apšviečia specialiai sukalibruotą UV šviesą, o mašina fiksuoja švytinčių fragmentų vaizdą.

Metileno mėlyna

Jei ultravioletinių spindulių apšvietimo aparato nėra arba jis nėra praktiškas, technikai gali padaryti DNR matomą įprastomis sąlygomis paruoštą agarozės gelį, kurio viduje yra elektroforezuota DNR, metileno mėlynojo tirpale per naktį.

Chlorido druska su žymiai hidrofobišku anijonu, metileno mėlynosios molekulės prasiskverbia per visą gelio matricą. Tačiau vandenilio jungtis visoje DNR sukelia dėmių molekulių kaupimąsi. Šis padidėjęs DNR dėmių tankis suteikia gilesnį mėlyną atspalvį, matomą plika akimi.

Dažų sekimas

Be santykinio DNR juostų dydžio, technikai gali išmatuoti absoliutų kiekvieno fragmento dydį (bazinėse porose) naudodami chemines medžiagas, vadinamus sekimo dažais. Matomi be metileno mėlynojo ar etidžio bromido, stebėjimo dažai, tokie kaip bromfenolio mėlynasis ir ksileno cianolis, juda aragozės gelio matricos elektroforezės metu tokiu pat greičiu kaip ir DNR fragmentai, susidedantys iš 300 nukleotidų ir 4000 nukleotidų, atitinkamai. Atliekant elektroforezę, masyvesni DNR fragmentai eina per gelio matricą lėčiau nei mažesni fragmentai. Todėl, nors sekimo dažai neturi tiesioginės įtakos DNR fragmentų matomumui, lyginant DNR fragmentų padėtį gelyje iki šių dažų padėties, technikai gali „pamatyti“ apytikslį DNR fragmento nukleotidų skaičių yra.

  • Dalintis
instagram viewer