Dirbant su didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC), norint užtikrinti patikimus ir kokybiškus rezultatus, būtinas geras kalibravimas. Tinkamas HPLC prietaiso kalibravimas prasideda nuo tinkamo kalibravimo etalono sukūrimo. Daugeliu atvejų kalibravimui iš tikrųjų reikia didesnės koncentracijos standartų, kad būtų sukurta vadinamoji kalibravimo kreivė. Tai brėžta linija ir susijusi lygtis, apibūdinanti ryšį tarp bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ir HPLC detektoriaus atsako.
Nustatykite cheminę medžiagą, kurią norite tirti naudodami HPLC („analitę“). Pavyzdžiui, galbūt norėsite išbandyti gaiviųjų gėrimų seriją dėl fruktozės kiekio, tokiu atveju fruktozė būtų analitė.
Gaunamas tinkamo grynumo analizuojamos cheminės medžiagos kiekis. Paprastai grynumas turėtų būti didesnis nei 99%, o analitę reikia įsigyti iš patikimos cheminių medžiagų tiekimo įmonės. Pavyzdžiui, fruktozės atveju gryną fruktozę pirktumėte iš cheminių medžiagų pardavėjo, o ne iš maisto prekių parduotuvės.
Nustatykite didžiausią ir mažiausią numatomą analitės koncentraciją mėginiuose, kuriuos ketinate tirti HPLC. Nealkoholinių gėrimų atveju turėtumėte ištirti gėrimų etiketes ir nustatyti mažiausią ir didžiausią fruktozės kiekį tarp testuojamų gėrimų. Turėkite omenyje, kad ruošiant analizę pradinis mėginys (gaivusis gėrimas) gali būti atskiestas ar kitaip juo manipuliuojamas (priklausomai nuo naudojamo HPLC metodo), taigi analizuojamosios medžiagos koncentracija mėginiuose, iš tikrųjų įpuršktu į HPLC, gali būti modifikuotas. Būtina atsižvelgti į analitės koncentraciją mėginiuose, atliktuose pagal HPLC.
Norėdami nustatyti kalibravimo etalonus, nustatykite tirpiklį, kuriame ištirpsite analitę. Šis tirpiklis turi sugebėti tinkamai ištirpinti analitę per gana plačią koncentracijos sritį (bent jau tokią pat, kokia yra mėginiuose, kuriuos ketinate tirti). Idealiu atveju šis tirpiklis turėtų būti gana panašus į „judamąją fazę“: tirpiklį, naudojamą mėginiams pernešti per HPLC prietaisą.
Apskaičiuokite analitės kiekį, reikalingą „pradiniam etaloniniam“ tirpalui paruošti. Tai nustatoma padauginus reikiamą atsargų etalono koncentraciją iš norimo tūrio. Analitės koncentracija šiame tirpale turėtų būti bent 10% didesnė už didžiausią numatomą mėginio koncentraciją. Jei didžiausia numatoma fruktozės koncentracija gaiviųjų gėrimų mėginyje yra 8 gramai / 100 mililitrų, pradinį etaloną galima nustatyti iki 10 gramų fruktozės / 100 mililitrų. Pagrįstas tūris yra 500 mililitrų, taigi reikėtų 8/100 ml x 500 ml = 40 gramų fruktozės.
Pasverkite reikiamą analitės kiekį tinkamu tikslumu. Dažnai svorio vertė gramais, tiksli viena ar dvi dešimtosios tikslumu, yra tinkama, tačiau kai kuriems metodams gali prireikti didesnio tikslumo.
Pasvertą analitę perpilkite į reikiamo tūrio matavimo kolbą ir į kolbos užpildymo žymę įpilkite norimo tirpiklio. Naudojant matavimo kolbą (o ne, pavyzdžiui, stiklinę su matuokle), padidėja pradinės standartinės koncentracijos vertės tikslumas. Užtikrinkite, kad visa analitė būtų perkelta į kolbą; jei reikia, naudokite šiek tiek tirpiklio.
Padarykite įvairaus pradinio etalono praskiedimų seriją, perpildami žinomus pradinio etalono tūrius į matavimo kolbas, naudodami pipetes tiksliam perkėlimui, tada pridėdami tirpiklio. Mažiausia standartinė koncentracija turėtų būti mažesnė už mažiausią numatomą analizuoti mėginį. Gaiviųjų gėrimų pavyzdyje, jei mažiausia numatoma fruktozės koncentracija mėginyje yra 2 gramai / 100 ml, tada galima būtų pagaminti 1 gramo / 100 ml standartą. Tai būtų padaryta dešimteriopai praskiedžiant atsargų standartą. Standartinėje serijoje turėtų būti iš viso 5 arba 6 koncentracijos, todėl norint gauti 3, 5 ir 8 gramų fruktozės / ml standartus, reikės papildomų praskiedimų. Dabar turite seriją standartinių sprendimų, kuriais kalibruosite HPLC.