위스콘신 대학의 BioWeb 웹 사이트에 따르면 PCR 프라이머는 짧은 합성 올리고 뉴클레오티드 (보통 18 폴리머 라제 연쇄 반응으로 알려진 분자 생물학 기술에서 DNA의 특정 영역을 증폭하는 데 사용됩니다. (PCR). 원하는 DNA 영역의 측면과 결합을 위해 DNA 가닥의 역 보체로 설계된 정방향 및 역방향 프라이머가 모두 필요합니다. 과학자가 특정 유전자 또는 DNA 영역에 대한 연구를 수행하려면 먼저 PCR을 수행하여 작업 할 대상 영역을 충분히 확보해야합니다. 관심 영역에 대한 프라이머 서열을 설계하는 것은 이전에 발표 된 연구 또는 상업적 수단을 통해 아직 이용 가능하지 않은 경우 필요할 수 있습니다.
관심있는 유전자 또는 DNA 영역의 뉴클레오티드 서열을 얻고 증폭하려는 단편을 결정합니다. 정방향 및 역방향 프라이머는 원하는 단편의 시작과 끝에서 결합하도록 설계되었습니다. 일반적으로 기존의 PCR 방법은 100 ~ 1,000 개 염기쌍 길이의 영역 옆에있는 프라이머를 사용하는 반면, 실시간 PCR 방법은 약 50 ~ 200 개 염기쌍 길이의 단편을 사용합니다.
시퀀스에서 프라이머를 놓을 위치를 결정하십시오. 예를 들어 시퀀스의 5 '또는 3'끝 근처 또는 중간 위치를 원할 수 있습니다. 원하는 경우 인트론에 걸쳐있는 프라이머의 위치를 지정합니다.
길이가 18 ~ 24 염기가되도록 프라이머를 디자인합니다. 빈센트 R. Brinkmann Instruments Inc.의 Prezioso, Ph.D.는이 길이가 원하는 DNA 영역에 극히 특이 적으로 나타나기에 충분히 길지만 쉽게 결합 (어닐링) 할 수있을만큼 짧다고 제안합니다. 프라이머 용융 온도 (Tm)는 섭씨 55 ~ 80도 사이 여야하며 섭씨 90도 이상에서 완전히 녹을 수있을만큼 낮지 만 어닐링이 가능할 정도로 높아야합니다. GC 함량 (시퀀스에서 G 및 C의 백분율)은 40 ~ 60 % 여야합니다. 프라이머 서열의 3 '말단은 결합을 촉진하기 위해 C 또는 G (GC 클램프라고 함)로 끝나야합니다. 뉴클레오타이드는 더 강한 결합을 갖지만, 서열의 마지막 5 개 염기에 3 개 이상의 G 또는 C를 갖는 것을 피하십시오.
하나의 염기 (ACCCC ...와 같은)를 4 개 이상 실행하거나 ATATATAT와 같은 4 개 이상의 디 뉴클레오티드 반복을 실행하지 마십시오. 프라이머 내 상 동성이없는 프라이머를 설계합니다 (하나 내에서 보완하는 3 개 이상의 염기 프라이머 자체) 또는 프라이머 간 상 동성 (정방향 및 역방향 프라이머가 보완 시퀀스). 이것은 프라이머가 원하는 DNA 서열에 결합하는 대신 자체적으로 결합하는자가 이량 체 또는 프라이머 이량 체를 유발할 수 있습니다.
프라이머 디자인을 돕거나 프라이머 서열의자가 보 완성 또는 헤어핀과 같은 2 차 구조를 만들 가능성을 확인하는 데 도움이되는 온라인 리소스 및 웹 사이트를 사용하십시오. 일부 프라이머 디자인 웹 사이트에는 Massachusetts Institute of Technology의 Primer3, National Center for Biotechnology Information의 Primer-Blast 및 Integrated DNA Technologies의 OligoAnalyzer가 있습니다.