წებოვანი დაბოლოების ფერმენტების გამოყენების უპირატესობები

მოლეკულური კლონირება ჩვეულებრივი ბიოტექნოლოგიური მეთოდია, რომელსაც ყველა სტუდენტი და მკვლევარი უნდა იცნობდეს. მოლეკულური კლონირება ფერმენტის სახეობის გამოყენებით, რომელსაც ეწოდება შეზღუდვის ფერმენტი, ადამიანის დნმ – ის ფრაგმენტებად გადასაჭრელად, რის შემდეგაც შესაძლებელია ბაქტერიული უჯრედის პლაზმურ დნმ – ში ჩასმა. შეზღუდვის ფერმენტები ორმაგ ჯაჭვურ დნმ-ს შუაზე აჭრიან. შეზღუდვის ფერმენტის გათვალისწინებით, ჭრილს შეუძლია გამოიწვიოს წებოვანი დაბოლოება ან ბლაგვი დაბოლოება. წებოვანი დაბოლოებები უფრო სასარგებლოა მოლეკულური კლონირებისთვის, რადგან ისინი უზრუნველყოფენ ადამიანის დნმ – ის ფრაგმენტის სწორ მიმართულებით პლაზმიდში შეყვანას. ლიგირების პროცესი ან დნმ – ის ფრაგმენტების შერწყმა მოითხოვს ნაკლებ დნმ – ს, როდესაც დნმ – ს წებოვანი ბოლოები აქვს. დაბოლოს, მრავალი წებოვანი დაბოლოების შემზღუდველი ფერმენტები შეიძლება წარმოქმნან ერთი და იგივე წებოვანი დაბოლოება, მიუხედავად იმისა, რომ თითოეული ფერმენტი აღიარებს განსხვავებული შეზღუდვის თანმიმდევრობას. ეს ზრდის ალბათობას, რომ თქვენი დნმ-ის საინტერესო რეგიონი შეიძლება ამოიჭრას წებოვანი ბოლოს ფერმენტებით.

შეზღუდვის ფერმენტები არის ფერმენტები, რომლებიც ჭრიან სპეციფიკურ თანმიმდევრობებს ორმაგ ჯაჭვურ დნმ-ზე და ამ თანმიმდევრობით დნმ-ს შუაზე აჭრიან. აღიარებულ თანმიმდევრობას ეწოდება შეზღუდვის ადგილი. შეზღუდვის ფერმენტებს ენდონუკლეაზებს უწოდებენ, რადგან ისინი აჭრიან ორმაგ ჯაჭვურ დნმ-ს, ანუ ჩვეულებრივ დნმ-ს, დნმ-ის ბოლოებს შორის მდებარე ადგილებში. 90-ზე მეტი განსხვავებული შეზღუდვის ფერმენტია. თითოეული ცნობს შეზღუდულ საიტს. შეზღუდვის ფერმენტები შესაბამის შეზღუდვის უბნებს 5000-ჯერ უფრო ეფექტურად აშორებენ, ვიდრე სხვა საიტები, რომლებსაც ისინი არ ცნობენ.

შეზღუდვის ფერმენტები გვხვდება ორ ზოგად კლასში. მათ ან მოჭრეს დნმ წებოვან ბოლოებად, ან ბლაგვ ბოლოებად. წებოვან დაბოლოებას აქვს ნუკლეოტიდების მოკლე რეგიონი, დნმ-ის საშენი მასალა, რომელიც არ არის დაწყვილებული. ამ დაწყვილებულ რეგიონს ზედმეტი ეწოდება. ამბობენ, რომ გადახურვა წებოვანია, რადგან მას სურს და დაწყვილდება სხვა წებოვან დასასრულთან, რომელსაც აქვს დამატებითი გადახურვის თანმიმდევრობა. წებოვანი ბოლოები დიდი ხნის წინ დაკარგული ტყუპებივითაა, როგორც კი ერთმანეთს შეხვედრის შემდეგ ერთმანეთს მჭიდროდ ჩაეხუტება. მეორეს მხრივ, ბლაგვი ბოლოები არ არის წებოვანი, რადგან ყველა ნუკლეოტიდი უკვე დაწყვილებულია დნმ-ის ორ ძაფს შორის. წებოვანი ბოლოების უპირატესობა ის არის, რომ ადამიანის დნმ-ის ფრაგმენტი შეიძლება მხოლოდ ბაქტერიულ პლაზმიდში მოხვდეს ერთი მიმართულებით. ამის საპირისპიროდ, თუ ადამიანის დნმ-სა და ბაქტერიულ პლაზმიდს აქვს ბლაგვი ბოლოები, ადამიანის დნმ-ის პლაზმიდაში ჩასმა შესაძლებელია კუდ-კუდიდან ან კუდიდან მიყოლებით.

მიუხედავად იმისა, რომ დნმ – ს ჯოხიანი ბოლოები უადვილდებათ ერთმანეთის პოვნა მათი „წებოვნების“ გამო, არც წებოვანი დაბოლოებები და არც ბლაგვი ბოლოები ვერ დნმ – ის უწყვეტ ნაწილად იქცევიან. დნმ-ს უწყვეტი ნაწილის ფორმირება, რომელიც მთლიანად არის დაკავშირებული, საჭიროებს ფერმენტს, რომელსაც ლიგაზა ეწოდება. ლიგაზები აკავშირებს ნუკლეოტიდების ხერხემალს წებოვან ან ბლაგვ ბოლოებზე, რის შედეგადაც ხდება ნუკლეოტიდების უწყვეტი ჯაჭვი. იმის გამო, რომ წებოვანი დაბოლოებები ერთმანეთს უფრო სწრაფად პოულობენ ერთმანეთისადმი მათი მიზიდულობის გამო, ლიგირების პროცესს ადამიანის ნაკლები დნმ და პლაზმური დნმ სჭირდება. დნმ-ის და პლაზმიდების ბლაგვი ბოლოები ნაკლებად პოულობენ ერთმანეთს და ამრიგად, ბლაგვი ბოლოების ლიგირება მოითხოვს უფრო მეტ დნმ-ის შეყვანას სინჯარაში.

შეზღუდვის ადგილები მდებარეობს ორგანიზმების მთელ გენომში, მაგრამ თანაბრად არ არის დაშორებული. პლაზმიდებში ისინი შეიძლება შეიქმნას ისე, რომ განლაგდნენ ერთმანეთის გვერდით. მეცნიერებმა, რომელთაც სურთ ადამიანის დნმ – ის ფრაგმენტი ამოიღონ ადამიანის გენომიდან, უნდა იპოვონ შეზღუდვის ადგილები, რომლებიც ფრაგმენტის რეგიონის წინა და უკანა მხარეა. გარდა ამისა, დნმ – ის ფრაგმენტის სწორი მიმართულებით ჩასმის უზრუნველყოფას, სხვადასხვა წებოვანი დაბოლოების ფერმენტებს შეუძლიათ შექმნან იგივე წებოვანი დაბოლოება, მიუხედავად იმისა, რომ ისინი აღიარებენ სხვადასხვა შეზღუდვის თანმიმდევრობას. მაგალითად, BamHI, BglII და Sau3A განსხვავებული ცნობის მიმდევრობაა, მაგრამ აწარმოებენ იგივე GATC წებოვან ბოლოს. ეს ზრდის ალბათობას, რომ არსებობდეს წებოვანი ბოლოს შეზღუდვის ადგილები, რომლებიც თქვენს ინტერესს წარმოადგენს თქვენი ადამიანის გენი.