როგორ მზადდება რეკომბინანტული დნმ?

რეკომბინანტული დნმ (დეოქსირიბონუკლეინის მჟავა) წარმოადგენს ნუკლეინის მჟავის სინთეზურ ტიპს, რომელიც იქმნება დნმ-ს კავშირით. თანმიმდევრობები, რომლებიც ბუნებრივად არ არსებობდნენ ნორმალურ გარემოებებში პირობები

რეკომბინანტული დნმ-ის მიღების პროცესი ჩვეულებრივ ხდება რეკომბინანტული პლაზმიდით. კერძოდ, იგი დამზადებულია ბიოლოგიასა და გენეტიკაში მოწინავე დნმ ტექნოლოგიური პროცედურის საშუალებით, რომელიც ცნობილია, როგორც გენების კლონირება. რეკომბინანტული დნმ მოთავსებულია უჯრედში, რომელიც შემდეგ გამოიმუშავებს სრულიად ახალ ცილას და გამოიყენება წამლების, ანტისხეულების ან სპეციფიკური ცილების სინთეზისთვის მხოლოდ კვლევისთვის.

დონორის ორგანიზმიდან ან ბიოლოგიური წყაროდან დნმ ჯერ უჯრედებიდან იღება და შემდეგ ექვემდებარება ჭრის პროცესს, რომელიც ცნობილია როგორც ფერმენტული შეზღუდვა. ეს წარმოქმნის დნმ – ის ფრაგმენტებს, რომლებიც შეიცავს თქვენთვის საინტერესო გენს ან გენებს. ამის შემდეგ შესაძლებელია ამ ფრაგმენტების "კლონირება" (ანუ ჩასმა) ან ჩარჩოება მიმღები ორგანიზმის ფრაგმენტებზე.

შემდეგ ისინი შეჰყავთ დნმ-ის უფრო დიდ მოლეკულებში ("რეკომბინანტული პლაზმიდი"), რომლებიც მოთავსებულია ბაქტერიებში და მრავლდება. ამის შემდეგ აღდგება და გადამოწმებულია რეკომბინანტული დნმ.

წაიკითხეთ მეტი რეკომბინანტული დნმ ტექნოლოგიის დადებითი და უარყოფითი მხარეების შესახებ.

დნმ ჯერ უნდა მოპოვდეს და გაიწმინდოს სხვა ფიჭური მოლეკულებისგან, როგორიცაა რიბონუკლეინის მჟავები (RNA), ცილები და სტრუქტურები, როგორიცაა უჯრედის მემბრანა. კლონირების მიზნით, დნმ მიიღება ბირთვიდან და ცნობილია როგორც "გენომური დნმ". დნმ-ის ერთი საერთო მეთოდი ექსტრაქცია ხდება უჯრედის კომპონენტების ულტრაცენტრიფუგირებით, სიმკვრივის გრადიენტში, რომელიც შედგება ცეზიუმში ეთიდიუმ ბრომიდით ქლორიდი.

გარდა ამისა, დნმ-ის აღსადგენად შეიძლება გამოყენებულ იქნას მთელი რიგი ტუტე და მარილის ბუფერული რეცხვა. მას შემდეგ, რაც ეს დაილექება და გაწმენდილი იქნება ყველა სხვა არასასურველი დამაბინძურებლებისგან, დნმ-ის ფრაგმენტებად მიღება შეიძლება.

შეზღუდვის ფერმენტები არის ფერმენტები, რომლებიც წყვეტენ ძალიან სპეციფიკურ დნმ-ის მიმდევრობებს; ისინი გამოიყენება დნმ-ის უნიკალური ფრაგმენტების შესაქმნელად. ეს პროცესი უზრუნველყოფს, რომ არაზუსტი, არასწორი ან არასასურველი თანმიმდევრობა წარმოიქმნას და გახდეს შემთხვევით შედის საბოლოო რეკომბინანტულ დნმ-ში, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს როგორც ექსპერიმენტული უკმარისობა, ასევე უჯრედის სიკვდილი.

სასურველი დნმ ფრაგმენტების წარმოსაქმნელად, სპეციფიკური ცალკეული ფერმენტის (ან ცალკეული) კომბინაცია გამოიყენება დნმ-ის ამოსაჭრელად ან ასათვისებლად. შემდეგ ფრაგმენტები იწმინდება გელის ელექტროფორეზით, რაც მათ გამოყოფს არასასურველი დნმ-ისგან. ნედლი დნმ-ის ტექნოლოგიის მეთოდი უბრალოდ მოიცავს მექანიკურ გაჭრას, რაც გრძელი დნმ-ის სეგმენტებს აყრის უფრო პატარა ზომის, რომელთა გამოყენებაც შეიძლება კლონირებისთვის.

ლიგირება არის დონორისა და მიმღების (ან ვექტორული) დნმ ფრაგმენტების შეკავების ან შეერთების პროცესი, რათა შეიქმნას რეკომბინანტული პლაზმური დნმ-ის მოლეკულა. იდეალურ შემთხვევაში, ფრაგმენტების შესაქმნელად არჩეული შეზღუდვის ფერმენტები ძალიან ფრთხილად იქნებოდა გააზრებული და ისეთი შემუშავებული, რომ მათ საშუალება მიეცათ ამ ბიტების აწყობას, როგორც Jigsaw თავსატეხი.

ამისათვის სასურველია შეზღუდვის ფერმენტები, რომლებიც აწარმოებენ თავსებად "წებოვან ბოლოებს", ისეთი, რომ ყველა თავსებადი ფრაგმენტი ბუნებრივად შეუერთდება ერთმანეთს. წინააღმდეგ შემთხვევაში, დნმ ლიგაზას ფერმენტის გამოყენება შესაძლებელია დნმ სეგმენტების ფოსფოდიესტერული კავშირებით შეერთებისთვის.

ტრანსფორმაციის ან სითბოს შოკის პროცესი გამოიყენება რეკომბინანტული დნმ-ის მოლეკულის მასპინძელ ბაქტერიულ უჯრედში ჩასაგდებად, რომელსაც შემდეგ შეუძლია შექმნას სინთეზური დნმ-ის მრავალი ასლი. ეს ბაქტერიები გაიზარდა აგარის ფირფიტებზე, კულტივირდება სპეციალურ ბაქტერიულ ბულიონებში და შემდეგ ხდება მათი ლიზირება რეკომბინანტული დნმ-ის გამოყოფის მიზნით. დაბოლოს, დნმ-ის გადამოწმება შესაძლებელია დნმ-ის თანმიმდევრობით, ფუნქციური ექსპერიმენტებით და შეზღუდული ფერმენტების მონელებით.

რეკომბინანტული დნმ ტექნოლოგია გამოიყენება აკადემიური ლაბორატორიული ექსპერიმენტებით დამთავრებული ფარმაცევტული წამლების შექმნით. ეს ასევე არის მნიშვნელოვანი ნაწილი დნმ-ის თანმიმდევრობისა და გენების იდენტიფიკაციისა.

შეგიძლიათ წაიკითხოთ მეტი ამის შესახებ დნმ ტექნოლოგია აქ.

წაიკითხეთ მეტი რეკომბინანტულ დნმ-სა და გენეტიკურ ინჟინერიას შორის სხვაობის შესახებ.