מה השלב הראשון בתגובת שרשרת פולימראז?

תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, היא טכניקה שמעתיקה קטע אחד של DNA לפרגמנטים רבים - רבים באופן אקספוננציאלי. השלב הראשון הוא ב- PCR הוא לחמם את ה- DNA כך שהוא ינתב, או יימס לגדילים בודדים. מבנה ה- DNA הוא כמו סולם חבלים בו השלבים הם חבלים עם קצוות מגנטיים. המגנטים מתחברים ליצירת שלבים, הנקראים זוגות בסיס, וכך מתנגדים להתפרקות. כל שבר של DNA נמס לגדילים בודדים בטמפרטורות שונות. הבנת האופן שבו מבנה ה- DNA מוחזק על ידי החלקים האישיים של ה- DNA תתן תובנה מדוע שברי DNA שונים נמסים בטמפרטורות שונות ומדוע יש צורך בטמפרטורות כה גבוהות בראשונה מקום.

השלב הראשון של ה- PCR הוא להמיס את ה- DNA כך ש- DNA דו-גדילי נפרד ל- DNA חד-גדילי. עבור DNA של יונקים, שלב ראשון זה כולל בדרך כלל חום של כ 95 מעלות צלזיוס (כ 200 פרנהייט). בטמפרטורה זו קשרי המימן בין צמדי בסיס A-T ו- G-C, או שלבים בסולם ה- DNA, מתפרקים ומרוכזים את ה- DNA הדו-גדילי. עם זאת, הטמפרטורה אינה חמה מספיק כדי לשבור את עמוד השדרה הפוספט-סוכר היוצר את החוטים הבודדים, או את עמודי הסולם. הפרדה מוחלטת של גדילים בודדים מכינה אותם לשלב השני של PCR, שמתקרר כדי לאפשר לשברי DNA קצרים, הנקראים פריימרים, לאגד את הגדילים היחידים.

אחת הסיבות ש- DNA מחומם לטמפרטורה הגבוהה של 95 מעלות צלזיוס היא שככל שהחוט הכפול של ה- DNA ארוך יותר, כך הוא רוצה להישאר יחד יותר. אורך ה- DNA הוא גורם אחד המשפיע על נקודת ההיתוך שנבחרה ל- PCR על אותה פיסת DNA. צמדי בסיס ה- A-T ו- G-C בקשר ה- DNA הכפול-גדילי זה עם זה כדי להחזיק את המבנה הכפול-גדילי. ככל שזוגי בסיס רצופים יותר בין שני גדילים בודדים נקשרו, כך גם שכניהם רוצים להיקשר, וככל שהמשיכה בין שני הגדילים תהיה חזקה יותר. זה כמו רוכסן עשוי מגנטים קטנים. כשאתה סוגר את הרוכסן, המגנטים באופן טבעי ירצו לרכוס ולהישאר מכווצים.

גורם נוסף המשפיע על איזו טמפרטורת ההיתוך לבחור עבור קטע ה- DNA המעניין אותך הוא כמות זוגות בסיסי ה- GC הקיימים באותו קטע. כל זוג בסיסים הוא כמו שני מיני מגנטים שמושכים. זוג עשוי G ו- C נמשך הרבה יותר חזק מאשר זוג A ו- T. לפיכך חתיכת DNA שיש בה יותר זוגות GC מאשר שבר אחר תדרוש טמפרטורה גבוהה יותר לפני שנמסה לחוטים בודדים. DNA קולט באופן טבעי אור אולטרה סגול - באורך הגל של 260 ננומטר, ליתר דיוק - ו- DNA חד-גדילי סופג יותר אור מאשר ה- DNA הדו-גדילי. אז מדידת כמות האור הנספגת היא דרך למדוד כמה ה- DNA הכפול-גדילי שלך נמס לגדילים בודדים. אפקט ה"רוכסן המגנטי "של צמדי בסיס GC ו- A-T הוא הגורם לגרף של ספיגת האור של דנ"א דו-גדילי מתוכנן כנגד עליית הטמפרטורה כדי להיות סיגואידלי, בצורת S, ולא a קו ישר. עקומת ה- S מייצגת את התנגדות עבודת הצוות שמפעילים זוגות הבסיס כנגד החום מכיוון שהם לא רוצים להפריד.

הטמפרטורה שבה אורך של DNA נמס לגדילים בודדים נקראת טמפרטורת ההיתוך שלה, שמסומנת בקיצור "Tm". זה מציין את הטמפרטורה בה מחצית ה- DNA בתמיסה נמסה לחוטים בודדים והחצי השני עדיין בחוט כפול טופס. טמפרטורת ההיתוך שונה עבור כל קטע של DNA. ל- DNA של יונקים תוכן G-C של 40%, כלומר 60% הנותרים מזוגות הבסיס הם As ו- Ts. תוכן ה- 40% G-C שלו גורם ל- DNA של יונקים להתמוסס ב -87 מעלות צלזיוס (כ- 189 פרנהייט). זו הסיבה שהצעד הראשון של PCR על DNA של יונקים הוא לחמם אותו ל 94 מעלות צלזיוס (201 פרנהייט). רק שבע מעלות חמות יותר מטמפרטורת ההיתוך וכל הגדילים הכפולים ימסו לחלוטין לחוטים בודדים.