כיצד נאסף מדגם DNA ומכינים אותו למחקר

לפני שהם יכולים לרצף DNA או לשנות אותו באמצעות הנדסה גנטית, על המדענים לבודד אותו תחילה. זו עשויה להיראות כמשימה קשה מכיוון שתאים מכילים מגוון רחב של תרכובות אחרות כמו חלבונים, שומנים, סוכרים ומולקולות קטנות. למרבה המזל, ביולוגים יכולים להשתמש בתכונות הכימיות של ה- DNA כדי להפריד בין ה- DNA לבין מזהמים אלה ולהכין אותו להמשך המחקר. תהליך זה נקרא מיצוי DNA.

ישנן טכניקות רבות ושונות המיועדות להפקת DNA. זו שמשמשת מעבדה בודדת תלויה בסוג הניסוי שיבוצע ובאיזו טהור צריך להיות ה- DNA. מדענים בדרך כלל מתחילים בדגימה המכילה תאים - למשל רקמת או דגימת דם - ושוברים את התאים פתוחים, או מבריקים אותם. ישנן מגוון דרכים בהן ניתן לפצות תאים. הוספת חומר ניקוי יגרום להם להתפרק, וכך גם להכפיף אותם לגלי קול בתדירות גבוהה. לחלופין, ערבוב המדגם עם חרוזי זכוכית ורטטו במהירות יפרק פיזית את התאים וישחרר את תוכנו.

אם אין צורך בטוהר גבוה, מדענים עשויים להוסיף אנזים הנקרא פרוטאינאז K כדי לפרק את רוב החלבונים במדגם ואז להשתמש בו כפי שהוא. טכניקה זו מלוכלכת מאוד, עם זאת, מכיוון שרוב המזהמים עדיין קיימים, ולכן היא מתאימה רק אם המהירות היא בראש סדר העדיפויות וטוהר אינו נושא. גישה מהירה ומלוכלכת נוספת היא הסרת חלבונים על ידי הגדלת ריכוז המלח על ידי הוספת מלחים כמו אמוניום או אשלגן אצטט כדי לאלץ את החלבונים לזרז. גם טכניקה זו מלוכלכת למדי מכיוון שעדיין קיימים מזהמים רבים אחרים.

גישה אחרת היא לייזר את התאים עם חומר ניקוי ואז לערבב את התמיסה עם אלכוהול איזואמייל, כלורופורם ופנול. לאחר מכן הפתרון נפרד לשתי שכבות. חלבונים מסתיימים בשכבה האורגנית העליונה, בעוד ש- DNA נשאר בשכבה המימית התחתונה. טכניקה זו דורשת שליטה זהירה בריכוז המלח וה- pH לקבלת תוצאות טובות. זה גוזל זמן, וגם הפנול וגם הכלורופורם הם כימיקלים רעילים ביותר. כתוצאה מכך, בעוד שמיצוי פנול-כלורופורם היה פעם שגרתי, טכניקות אחרות הפכו פופולריות יותר בשנים האחרונות.

כרומטוגרפיה של חילופי אניונים מציעה טוהר גבוה יותר ותוצאות עקביות יותר ממיצוי פנול-כלורופורם. צינור או עמוד ארוזים בחלקיקים קטנים שיש עליהם אתרים טעונים חיוביים שבהם מולקולה או אניון טעונים שלילית יכולים להיקשר. ה- DNA נקשר לאתרי חילופי האניונים הללו בעוד שמזהמים אחרים כמו חלבונים ו- RNA נשטפים מהעמוד. מאוחר יותר משתמשים בתמיסה עשירה במלח כדי למשוך את ה- DNA מהעמוד.

הטכניקה המהירה ביותר ואולי האמינה ביותר לטיהור DNA היא שימוש בערכה המיוצרת במיוחד. ערכות אלה מכילות קרומי סיליקה ג'ל בצינור. ה- DNA נצמד לקרום בעוד שמזהמים אחרים נשטפים באמצעות סדרת תמיסות מלח שהוכנו במיוחד המגיעות עם הערכה. לבסוף, הדנ"א נשטף מהעמוד בתמיסה דלה במלח. ערכות אלה מהירות, קלות לשימוש ומציעות תוצאות לשחזור.

לאחר הבדיקה של ה- DNA ומושע מחדש בתמיסת חיץ מבוקרת pH, השלב האחרון הוא לבדוק את טוהרו. דרך קלה ונוחה לעשות זאת היא לבדוק כמה אור אולטרה סגול הוא סופג באורכי הגל 260 ו -280 ננומטר. הקליטה ב -260 ננומטר חלקי הקליטה ב -280 ננומטר צריכה להיות שווה ל -1.8 אם ה- DNA טהור. מדידת הספיגה ב -260 ננומטר מאפשרת לך גם לקבוע את ריכוז ה- DNA.