התוכנית הגנטית של התא מקודדת בתוך החומר הגנטי שלו, או ה- DNA. מכיוון שה- DNA לעולם אינו עוזב את גרעין התא, על מנת שמידע זה ייכנס לציטופלזמה במקום אחר כאשר חלבונים ורכיבים ביוכימיים מתגוררים, יש צורך לתעתק תחילה את ה- DNA ל- RNA של שליח (mRNA או פולי (א) RNA). ה- mRNA הזה מתורגם לאחר מכן לחלבונים שמבצעים פונקציות רבות של התא. כדי לזהות או לכמת mRNA נדירים מאוד, ליצור בדיקות למערכי מיקרו או לבנות ספריות של מולקולות DNA משלימות, יש לבודד את ה- mRNA. עם זאת, מיצוי RNA מוחלט (כלומר כל ה- RNA בתא) ובידוד ה- mRNA שלאחר מכן אינם תהליכים בלעדיים זה לזה; יש לבצע את הראשון על מנת לחלץ את ה- mRNA.
הומוגניזציה של TRIzol: סך ה- RNA כולל את כל ה- mRNA, ה- RNA להעביר, ה- RNA הריבוזומלי ושאר הלא קידוד. RNAs. כדי להפריד בין רכיבים סלולריים אחרים, התא נפרץ תחילה כדי לשחרר את התאים תוכן. זה נעשה על ידי השעיה מחדש של תאים המופלטים על ידי צנטריפוגה (סיבוב במהירות גבוהה) ב TRIzol Reagent (Life Technologies). גרסאות אחרות של TRIzol (כגון מגיב ה- TRI של Ambion) פועלות באופן דומה.
בידוד RNA מוחלט: סדרת צנטריפוגציות משמשת להפרדת המרכיבים השונים (חלבונים, DNA, RNA) של התא לשכבות, או לשלבים, בתוך ההשעיה. השלב העליון בצבע צהוב מורכב משומן וניתן להשליך אותו. השלב הרצוי הוא כהה בצבע אדום, מכיל את ה- RNA הכולל ונשמר. לאחר ביצוע מיצוי פנול-כלורופורם וסדרה של שטיפות אלכוהול באמצעות איזופרופנול ואתנול, ניתן לקלף את ה- RNA לבידוד ה- mRNA. הוסף מעכבי RNase כדי למנוע מאנזים זה להשפיל את ה- RNA הכולל.
מיצוי mRNA: מקובל להשתמש בערכה לבידוד mRNA, מכיוון שפרוטוקולי מעבדה תוצרת בית אינם מייצרים כמויות גדולות של mRNAs מטוהרים מאוד. הערכות המסחריות כוללות את FastTrack 2.0 של Invitrogen או את בידוד ה- mRNA טהור Poly (A) של Ambion קִיט. שלבים בסיסיים אלה משותפים לערכות כאלה:
ד) צנטריפוגה מדגם זה ושחזר את תגובת שיקוע, הנשטפת מספר פעמים בסדרה של מאגרי כריכה ומלח נמוכים הניתנים בערכות.
הפניות
- "פרוטוקולי ספריית cDNA?"; איאן ג'י קאוול וקרוליין א. אוסטין; 1997
- "פרוטוקולי תמלול ותרגום חוץ גופית?"; מרטין ג'יי תימנים; 1995
טיפים
- שמור על כל ריאגנטים, תאים ו- RNA קר על ידי שקיעה בקרח. זה מונע את פירוק ה- RNA על ידי אנזימים אחרים שמשתחררים במהלך תהליך ההומוגניזציה.
אזהרות
- ריאגנטים כמו TRIzol רעילים ואינם חייבים להיות במגע עם עור או ריריות. הקפד תמיד על פרוטוקולי מעבדה בטוחים בעת טיפול בכיבוי זה.
על הסופר
פאלמר אוויונג הוא בעל תואר שני בעסקים בינלאומיים מאוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו בוגר תואר ראשון באמנויות בסוציולוגיה מאוניברסיטת קליפורניה בסנטה ברברה והינו מולקולרי מאומן ביולוג. הוא סופר עצמאי מאז 2006. בנוסף לכתיבה, הוא סוחר פורקס במשרה מלאה ומשווק באינטרנט.
נקודות זיכוי
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images