נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) היא שיטה ביוכימית לזיהוי חלבונים בתמיסה. כפי שמודגם על ידי מת'יוס ואחרים ב"ביוכימיה ", דגימות חלבונים נטענות תחילה ב"בארות" או חורים בקצה אחד של בלוק הג'ל הפולי-אריכאילמידי. לאחר מכן מוחל שדה חשמלי על הג'ל. SDS, שנוסף לדגימות הנטענות, שולל את המטען הטבעי של חלבונים. מסיבה זו, משקל מולקולרי של חלבון לבדו קובע את מהירות הנדידה של חלבונים כאשר הם נעים דרך הג'ל לעבר הקוטב הטעון החיובי, מציין Bitesize Bio. חלבונים מרובים באותה דגימה ייפרדו, אפוא, זה מזה ויעברו למיקומים שונים.
כוון את תצלום הג'ל. "למעלה" הוא מיקום הבארות בהן נוספו במקור הדגימות. "תחתון" הוא המקום בו הדגימות נדדו לעבר ומכילות לרוב את חזית הצבע המציינת את חזיתן הנודדת של הדגימות. שמאל או ימין צריכים להכיל "סמן", המשמש כמדריך משקל מולקולרי צפוי.
תייג את הדגימות לכל נתיב. בחלקו העליון, הדגימות שנוספו לבארות יעברו אנכית ב"נתיבים ". לכן, כל הסורגים הנראים בעמודה אנכית הגיעו מהדגימה האחת שנטענה ישירות מעליה. השתמש בסרגל ובעט כדי להציב גבולות בנתיבים אם קשה לדמיין עמודות.
תייג את הגודל המולקולרי של הלהקות בנתיב הסמן. סמנים זמינים מסחרית מגיעים עם תמונה של תבנית הלהקה שניתן לצפות לה יחד עם המשקולות המולקולריות של כל רצועה. להקות הן ה"סורגים "האופקיים הכהים, שהם למעשה חלבון מוכתם המוטמע בג'ל.
צייר קווים אופקיים קלים המשתרעים החוצה מכל רצועת סמן לקצה הנגדי של הג'ל. היזהר להפוך קווים אלה מקבילים לבארות ולחזית הצבע. שורות אלה מציינות היכן יהיו חלבונים במשקל המולקולרי המצוין על ידי כל אחת מרצועות הסמן בכל נתיב. לדוגמא, פס בנתיב 4 השוכן ממש מתחת לקו המורחב מה -25 קילודלטון רצועת סמן תציע שהפס של מסלול 4 הוא כמעט אך לא ממש 25 קילודלטון במולקולרית מִשׁקָל.
תייג כל פס בכל נתיב עם משקלו המולקולרי המשוער. השתמש בסמנים כמדריך, והעריך ערכים בין גדלי הסמן.
מתחת לתצלום הג'ל הכינו רשימה של "חלבונים" לכל נתיב. התחל בלציין מה ידוע על כל דגימה, כגון מקורו או תנאיו. ואז רשום את המשקל המולקולרי המשוער של כל פס בנתיב. נתיבים עם פס אחד מצביעים על כך שהמדגם מכיל חלבון אחד בלבד. נתיבים עם רצועות מרובות מצביעים על קיומם של חלבונים מרובים. להקות הפועלות עם חזית ההעברה הן קטנות יותר מההצעה של הסמן הקרוב ביותר וסביר להניח שלא ניתן לחזות אותן אלא כ"קטן ממה "שהסמן מציין.
ברשימת החלבונים, שימו לב למוזרויות. מראה "מרוח" יכול להצביע על כך שיש יותר מדי חלבונים או שצמיגות הדגימה השפיעה על נדידתו אם נראה שהלהקות חורגות מה בקצה הנתיב או שהם גדולים למדי בהשוואה לפסים אחרים, סביר להניח שריכוז החלבון גבוה מדי ויש לדלל אותו בעתיד אלקטרופורזה. גוון אפרפר לאורך הנתיב, כהה יותר מצבע ג'ל הרקע, מעיד על שברי חלבון שלא ניתן להבחין בהם.
קבע את זהות החלבונים בכל נתיב. למרות שהדבר נעשה תוך שימוש במשקל מולקולרי בלבד, מקורו של כל נתיב עשוי להצביע גם על רמזים. קחו בחשבון שבתנאים מסוימים, חלבונים יכולים לשמור על קשר דימר או טרימר על ג'ל. לכן, חלבון אחד עשוי להופיע על ג'ל כשלוש להקות שונות. גם אם לא ניתן לזהות חלבונים, החושך היחסי של הלהקות יכול לרמוז על ריכוזי החלבונים בתמיסה. ניתן לבודד כל חלבון מוזר ובלתי ידוע ישירות מהג'ל המקורי ולשלוח אותו לזיהוי.
דברים שתזדקק להם
- תצלום של ג'ל SDS-PAGE, מוכתם
- מפתח לסמן משקל מולקולרי בשימוש
- סרגל
- עֵט