I chimici utilizzano la cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, per separare le miscele di composti. In generale, il metodo consiste nell'iniettare un campione in una colonna dove si mescola con uno o più solventi. Diversi composti si adsorbono o si "attaccano" alla colonna in gradi diversi; e mentre il solvente spinge i composti attraverso la colonna, uno dei componenti della miscela uscirà per primo dalla colonna. Lo strumento rileva i composti quando escono dalla colonna e produce un cromatogramma che consiste in un grafico con il tempo di ritenzione sull'asse x e l'intensità del segnale dal rivelatore sull'asse y. Quando i composti escono dalla colonna, producono "picchi" nel cromatogramma. In generale, più distanti e stretti sono i picchi nel cromatogramma, maggiore è la risoluzione. Gli scienziati considerano una risoluzione di 1.0 o superiore per rappresentare una separazione adeguata.
Misurare le larghezze di due picchi adiacenti nel cromatogramma annotando dove si trovano i valori dell'asse x alla base di ciascun picco. L'asse x rappresenta il tempo di ritenzione, solitamente misurato in secondi. Pertanto, se un picco inizia a 15,1 secondi e termina a 18,5 secondi, la sua larghezza è (18,5 - 15,1) = 3,4 secondi.
Determinare i tempi di ritenzione annotando il tempo, cioè la posizione sull'asse x, che corrisponde alle posizioni dei massimi dei picchi. Questo valore sarà normalmente circa a metà tra i due valori utilizzati per calcolare la larghezza nel passaggio 1. L'esempio fornito nel passaggio 1, ad esempio, mostrerebbe un massimo a circa 16,8 secondi.
Calcola la risoluzione, R, tra due picchi con:
R=\frac{RT_1-RT_2}{0.5(W_1+W_2)}
dove RT1 e RT2 rappresentano i tempi di ritenzione dei picchi 1 e 2, e W1 e W2 rappresentano le larghezze dei picchi presi alle loro basi. Continuando l'esempio dalle fasi 2 e 3, un picco presenta un tempo di ritenzione di 16,8 secondi e un'ampiezza di 3,4 secondi. Se il secondo picco mostrasse un tempo di ritenzione di 21,4 secondi con un'ampiezza di 3,6 secondi, la risoluzione sarebbe:
R=\frac{21,4-16,8}{0,5(3,4+3,6)}=1,3
Cose di cui avrai bisogno
- Cromatogramma HPLC
- Calcolatrice