Le membrane cellulari sono costituite da fosfolipidi e proteine attaccate o incorporate. Le proteine di membrana svolgono ruoli vitali nel metabolismo e nella vita della cellula. Non è possibile utilizzare la normale microscopia per visualizzare o caratterizzare proteine di adesione, proteine di trasporto e canali proteici nella membrana cellulare. Usando la microscopia elettronica e una tecnica chiamata "frattura da congelamento", che divide le membrane cellulari congelate, consente la visualizzazione della struttura della membrana e l'organizzazione delle proteine all'interno del mare di fosfolipidi. La combinazione di altri metodi con la fratturazione da congelamento non solo ci aiuta a comprendere la struttura delle diverse membrane cellulari e proteine di membrana, ma consente la visualizzazione e l'analisi dettagliata della funzione di specifiche proteine, batteri e virus.
Passaggi di base nella frattura da congelamento
Utilizzando azoto liquido, campioni di tessuto biologico o cellule vengono rapidamente congelati per immobilizzare i costituenti cellulari. Le membrane cellulari sono composte da due strati di fosfolipidi, chiamati doppio strato, dove le code lipidiche idrofobe, o che odiano l'acqua, puntano a l'interno della membrana e le estremità idrofile, o amanti dell'acqua, della molecola lipidica puntano verso l'esterno e verso l'interno del cellula. Il campione congelato viene incrinato o fratturato con un microtomo, che è uno strumento simile a un coltello per tagliare sottili fette di tessuto. Questo fa sì che la membrana cellulare si divida proprio tra i due strati perché l'attrazione tra le code lipidiche idrofobe rappresenta il punto più debole. Dopo la fratturazione, il campione viene sottoposto a una procedura sotto vuoto, chiamata "freeze etching". La superficie del fratturato il campione viene ombreggiato con carbonio e vapore di platino per creare una replica stabile, che segue i contorni della frattura aereo. L'acido viene utilizzato per digerire il materiale organico che aderisce alla replica, lasciando un sottile guscio di platino sulla superficie della membrana fratturata. Questo guscio viene quindi analizzato al microscopio elettronico.
Acquaforte congelata
La liofilizzazione è l'essiccazione sotto vuoto di un campione biologico non fissato, congelato e fratturato per congelamento. La procedura di essiccazione sottovuoto è simile alla liofilizzazione di frutta e verdura che vengono confezionate e vendute nei negozi di alimentari. Senza il congelamento molti dettagli della struttura cellulare sono oscurati dai cristalli di ghiaccio. La fase di mordenzatura profonda o di congelamento migliora ed estende il metodo originale di frattura da congelamento, consentendo l'osservazione delle membrane cellulari durante varie attività. Consente l'analisi non solo della struttura della membrana, ma anche dei componenti intracellulari e fornisce informazioni strutturali dettagliate su batteri, virus e grandi proteine cellulari complessi.
Microscopio elettronico
La microscopia elettronica può rivelare e ingrandire più di un milione di volte gli organismi o le strutture più piccoli, come batteri, virus, componenti intracellulari e persino proteine. La visualizzazione viene creata bombardando un campione ultrasottile con un fascio di elettroni. I due metodi di microscopia elettronica sono la microscopia elettronica a scansione, o SEM, e la microscopia elettronica a trasmissione, o TEM. I campioni di frattura da congelamento vengono analizzati di routine con TEM. TEM ha una risoluzione migliore rispetto a SEM e offre informazioni strutturali fino a 3 nanometri di repliche.
Rivelando la struttura della membrana cellulare
Lo sviluppo e l'uso della microscopia elettronica a frattura da congelamento ha mostrato che le membrane plasmatiche cellulari sono costituite da doppi strati lipidici e ha chiarito come le proteine sono organizzate all'interno delle membrane cellulari. La frattura da congelamento offre uno sguardo unico all'interno delle membrane cellulari, perché divide e separa i fosfolipidi di membrana in due fogli o facce opposte e complementari. Negli oltre 50 anni dall'introduzione della prima macchina per frattura da congelamento, realizzare una replica in platino è ancora l'unico modo per ottenere informazioni strutturali sulla membrana cellulare. La tecnica mostra se specifiche proteine galleggiano o sono ancorate nella membrana cellulare e se e come alcune proteine si aggregano. Un metodo più recente, che utilizza anticorpi che prendono di mira proteine specifiche, viene combinato con la frattura da congelamento per identificare le proteine e la loro funzione nella membrana cellulare.
