DNA
Acido desossiribonucleico e proteine. Il DNA è organizzato in unità chiamate geni, ognuno dei quali codifica per un particolare RNA o sequenza proteica. I geni sono studiati per conoscere la struttura e la funzione biologica, l'evoluzione, le malattie e molti altri aspetti dei sistemi viventi. Per studiare i geni in dettaglio, il DNA deve essere isolato e purificato dalle cellule di interesse.
Estrazione del DNA
Sebbene il DNA di una singola cellula possa essere estratto e studiato, non è sufficiente vedere ad occhio nudo. Per ottenere una quantità sufficiente per lo spooling, più celle devi lavorare meglio è (molti milioni).
I protocolli esatti variano considerevolmente per tenere conto delle caratteristiche uniche di campioni specifici, ma i passaggi generali sono l'omogeneizzazione, la lisi, la digestione, la separazione e la raccolta. La procedura viene eseguita al meglio in un piccolo tubo di vetro o plastica (a seconda delle dimensioni del campione).
Un campione viene generalmente miscelato o macinato per separare completamente le cellule l'una dall'altra. Questo rende gli ingredienti cellulari più accessibili ai reagenti che seguono. All'omogenato vengono quindi aggiunti detergenti o enzimi per lisare le membrane cellulari (e le membrane nucleari se le cellule sono eucariotiche) per liberare il DNA. A questo punto il DNA è circondato da proteine, lipidi, carboidrati e tutto il resto che era contenuto nelle cellule.
Potrebbe essere necessaria un'ulteriore digestione enzimatica per scomporre le proteine in modo che non si leghino al DNA e interferiscano con la sua raccolta. Il DNA viene separato dal resto del contenuto cellulare mediante l'aggiunta di alcol freddo, puro, etilico o isopropilico. Il DNA non è solubile in questi alcoli, quindi si condenserà per cercare di ridurre al minimo il suo contatto con l'alcol. Il DNA condensato viene quindi raccolto, solitamente mediante centrifugazione o spooling.
Spooling del DNA
La raccolta del DNA mediante spooling è efficace quando si ottiene una grande quantità di DNA da una procedura di estrazione. È anche un eccellente metodo dimostrativo poiché è chiaramente visibile un impressionante groviglio di DNA puro.
Per eseguire lo spool del DNA, la fase di separazione deve essere eseguita con attenzione. Se non faceva parte della miscela del reagente di lisi precedentemente aggiunta, alla soluzione deve essere aggiunta una soluzione salina concentrata (cloruro di sodio) prima della fase di aggiunta dell'alcol. L'alcol freddo viene versato lentamente lungo il lato della provetta per formare uno strato sopra la soluzione acquosa, evitando di mescolare. Se fatto correttamente, l'alcol formerà il proprio strato sopra lo strato salato. Poi arriva lo spooling.
Per raccogliere il DNA dallo strato salato, posizionare con cura un'asta di vetro attraverso lo strato di alcol fino a quando non tocca il fondo della provetta. Ruota lentamente l'asta tra le dita, osservando l'interfaccia tra i due strati. Se è presente una quantità sufficiente di DNA, si raggrupperà all'interfaccia tra gli strati per formare una massa traslucida lattiginosa. Ruota l'asta per avvolgere il DNA attorno ad essa (che è la parte di avvolgimento) ed estrailo dal tubo. Il DNA può essere trasferito in un'altra provetta di alcol puro per la conservazione o ulteriori analisi.