È possibile clonare interi organismi come la pecora Dolly, ma la clonazione del DNA è diversa. Utilizza tecniche di biologia molecolare per rendere copie identiche di sequenze di DNA o singoli geni.
Utilizzando metodi di ingegneria genetica, vengono identificati e isolati segmenti del codice genetico del DNA. La clonazione del DNA quindi copia il acido nucleico sequenze nei segmenti.
Le copie identiche risultanti possono essere utilizzate per ulteriori ricerche o per applicazioni biotecnologiche. Spesso il gene che viene copiato codifica per una proteina che può far parte dei trattamenti medici. Tecnologia del DNA inclusa clonazione del DNA sta sostenendo la comprensione di come funzionano i geni e di come il codice genetico degli esseri umani influenza il funzionamento del corpo.
Clonazione del DNA: definizione e panoramica del processo
La clonazione del DNA è il processo di biologia molecolare per creare copie identiche di segmenti di DNA situati nei cromosomi che contengono il codice genetico di organismi avanzati.
Il processo genera grandi quantità di sequenze di DNA bersaglio. Lo scopo della clonazione del DNA è produrre le stesse sequenze di DNA bersaglio o produrre le proteine codificate nelle sequenze bersaglio.
I due metodi utilizzati nella clonazione del DNA sono chiamati vettore plasmide e reazione a catena della polimerasi (PCR). Nel vettore plasmide metodo, i filamenti di DNA vengono tagliati usando enzimi di restrizione per produrre frammenti di DNA e i segmenti risultanti vengono inseriti in vettori di clonazione chiamati plasmidi per un'ulteriore duplicazione. I plasmidi sono posti in cellule batteriche che poi producono le copie del DNA o le proteine codificate.
Nel Metodo PCR, il segmento di filamenti di DNA da duplicare è contrassegnato con enzimi chiamati primer. Un enzima polimerasi crea copie della parte marcata del filamento di DNA. Questo metodo non utilizza enzimi di restrizione e può produrre DNA clonato da piccoli campioni. A volte i due metodi della tecnologia del DNA vengono utilizzati insieme per incorporare le migliori caratteristiche di ciascuno in una reazione complessiva.
Il metodo del vettore plasmidico
Il vettore del metodo si riferisce al plasmide utilizzato per contenere il segmento di DNA bersaglio da clonare. I plasmidi sono piccoli filamenti circolari di DNA non cromosomico trovato in molti organismi inclusi batteri e virus.
I plasmidi batterici sono il vettore utilizzato per inserire il segmento di DNA bersaglio nelle cellule batteriche per un'ulteriore duplicazione.
Selezione e isolamento del DNA bersaglio: Prima che il processo di clonazione del DNA possa iniziare, è necessario identificare le sequenze di DNA, in particolare l'inizio e la fine dei segmenti di DNA.
Tali sequenze di DNA possono essere trovate utilizzando DNA clonato esistente con sequenze note o studiando la proteina prodotta dalla sequenza di DNA bersaglio. Una volta nota la sequenza, possono essere utilizzati gli enzimi di restrizione corrispondenti.
Taglio del DNA bersaglio con enzimi di restrizione: Gli enzimi di restrizione vengono selezionati per cercare il codice del DNA all'inizio e alla fine delle sequenze bersaglio.
Quando gli enzimi di restrizione trovano una speciale sequenza codificata di coppie di basi chiamate siti di restrizione, si attaccano al DNA in quella posizione e si avvolgono attorno alla molecola di DNA, recidendo il filo. I segmenti di DNA tagliati contenenti la sequenza target sono ora disponibili per la duplicazione.
Scelta del vettore plasmidico e inserimento del DNA target: Un plasmide adatto contiene idealmente le stesse sequenze codificanti di DNA del filamento di DNA da cui è stato tagliato il DNA bersaglio. Il filamento circolare di DNA del plasmide viene tagliato con gli stessi enzimi di restrizione usati per tagliare il DNA bersaglio.
UN Enzima DNA ligasiase viene utilizzato per promuovere il collegamento del segmento di DNA e le estremità del segmento di DNA bersaglio si collegano con le estremità tagliate del DNA plasmidico. Il DNA bersaglio ora fa parte del filamento circolare di DNA plasmidico.
Inserimento del plasmide in una cellula batterica: Una volta che il plasmide contiene la sequenza di DNA da clonare, la clonazione vera e propria può avvenire utilizzando un processo chiamato trasformazione batterica. I plasmidi vengono inseriti in una cellula batterica come E. coli e le cellule con i nuovi segmenti di DNA inizieranno a produrre copie e le corrispondenti proteine.
Nella trasformazione batterica, le cellule ospiti e i plasmidi vengono incubati insieme a temperatura corporea per circa 12 ore. Le cellule assorbono alcuni dei plasmidi e li trattano come il proprio DNA plasmidico.
Raccolta del DNA clonato e delle proteine: La maggior parte dei plasmidi utilizzati per la clonazione del DNA hanno geni di resistenza agli antibiotici incorporati nel loro DNA. Quando le cellule batteriche assorbono i nuovi plasmidi, diventano resistenti agli antibiotici.
Quando la coltura viene trattata con antibiotici, sopravvivono solo quelle cellule che hanno assorbito i nuovi plasmidi. Il risultato è una coltura pura di cellule batteriche con DNA clonato. Quel DNA può quindi essere raccolto o può essere prodotta la proteina corrispondente.
Il metodo PCR (reazione a catena della polimerasi)
Il PCR Il metodo è più semplice e copia il DNA esistente sul posto. Non richiede taglio con enzimi di restrizione o inserimento plasmideDNA sequenze. Ciò lo rende particolarmente adatto per la clonazione di campioni di DNA con un numero limitato di filamenti di DNA. Sebbene il metodo possa clonare il DNA, non può essere utilizzato per la produzione della proteina corrispondente.
Srotolare i filamenti di DNA: Il DNA nei cromosomi è strettamente avvolto in una struttura a doppia elica. Riscaldare il DNA a 96 gradi Celsius in un processo chiamato denaturazione fa sì che la molecola del DNA si srotoli e si separi in due filamenti. Questa separazione è necessaria perché solo un singolo filamento di DNA può essere clonato alla volta.
Selezione dei primer: Come per la clonazione del DNA del vettore plasmidico, le sequenze di DNA da clonare devono essere identificate con particolare attenzione all'inizio e alla fine dei segmenti di DNA. I primer sono enzimi che si attaccano a specifiche sequenze di codici di DNA e devono essere selezionati per contrassegnare i segmenti di DNA bersaglio. I primer giusti si attaccheranno alle sequenze della molecola del DNA per contrassegnare l'inizio e la fine dei segmenti bersaglio.
Ricottura della reazione per legare i primer: Viene chiamato il raffreddamento della reazione fino a circa 55 gradi Celsius ricottura. Quando la reazione si raffredda, i primer vengono attivati e si attaccano al filamento di DNA a ciascuna estremità di un segmento di DNA bersaglio. I primer agiscono solo come marcatori e il filamento di DNA non deve essere tagliato.
Produzione di copie identiche del segmento di DNA bersaglio: In un processo chiamato estensione, l'enzima TAQ polimerasi termosensibile viene aggiunto alla reazione. La reazione viene quindi riscaldata a 72 gradi Celsius, attivando l'enzima. L'enzima DNA polimerasi attivo si lega ai primer e copia la sequenza di DNA tra di essi. Il processo iniziale di sequenziamento e clonazione del DNA è completo.
Aumentare la resa del DNA clonato: Il processo di ricottura ed estensione iniziale crea relativamente poche copie dei segmenti di filamento di DNA disponibili. Per aumentare la resa attraverso un'ulteriore replicazione del DNA, la reazione viene nuovamente raffreddata per riattivare i primer e lasciarli legare ad altri filamenti di DNA.
Quindi, il riscaldamento della reazione attiva nuovamente l'enzima polimerasi e vengono prodotte più copie. Questo ciclo può essere ripetuto da 25 a 30 volte.
Utilizzo del vettore plasmidico e dei metodi di clonazione del DNA PCR insieme
Il metodo del vettore plasmidico si basa su un'ampia fornitura iniziale di DNA da tagliare e inserire nei plasmidi. Troppo poco DNA originale si traduce in un minor numero di plasmidi e un avvio lento della produzione di DNA clonato.
Il metodo PCR può produrre una grande quantità di DNA da pochi filamenti di DNA originali, ma poiché il DNA non è impiantato in una cellula batterica, la produzione di proteine non è possibile.
Per produrre la proteina codificata nei frammenti di DNA da clonare da un piccolo campione iniziale di DNA, i due metodi possono essere usati insieme e possono si completano a vicenda. Innanzitutto il metodo PCR viene utilizzato per clonare il DNA da un piccolo campione e produrre molte copie.
Quindi i prodotti della PCR vengono utilizzati con il metodo del vettore plasmidico per impiantare il DNA prodotto nelle cellule batteriche che produrranno la proteina desiderata.
Esempi di clonazione del DNA per la biotecnologia
La biologia molecolare utilizza la clonazione genica e la replicazione del DNA per scopi medici e commerciali. I batteri con sequenze di DNA clonate vengono utilizzati per produrre medicinali e sostituire sostanze che le persone con malattie genetiche non possono produrre da sole.
Gli usi tipici includono:
- Il gene per insulina umana viene clonato in batteri che poi producono l'insulina utilizzata dai diabetici.
- L'attivatore tissutale del plasminogeno è prodotto da DNA clonato e utilizzato per aiutare prevenire la formazione di coaguli di sangue.
- Ormone della crescita umano possono essere prodotti e somministrati a persone che non possono produrli da soli.
La biotecnologia utilizza anche la clonazione genica in agricoltura per creare nuove caratteristiche nelle piante e negli animali o migliorare le caratteristiche esistenti. Man mano che vengono clonati più geni, il numero di possibili usi aumenta in modo esponenziale.
Esempi di clonazione del DNA per la ricerca
Le molecole di DNA costituiscono una piccola frazione del materiale in una cellula vivente ed è difficile isolare le influenze dei molti geni. I metodi di clonazione del DNA forniscono grandi quantità di una specifica sequenza di DNA per lo studio e il DNA produce proteine proprio come ha fatto nella cellula originale. La clonazione del DNA permette di studiare questa operazione per diversi geni in isolamento.
Le applicazioni tipiche della ricerca e della tecnologia del DNA includono l'esame di:
- Funzione di un gene.
- Mutazioni di un gene.
- Espressione genica.
- Prodotti genetici.
- Difetti genetici.
Quando vengono clonate più sequenze di DNA, è più facile trovare e clonare sequenze aggiuntive. I segmenti di DNA clonati esistenti possono essere utilizzati per determinare se un nuovo segmento corrisponde a quello vecchio e quali parti sono diverse. L'identificazione di una sequenza di DNA target è quindi più rapida e accurata.
Esempi di clonazione del DNA per la terapia genica
Nel terapia genetica, un gene clonato viene presentato alle cellule di un organismo il cui gene naturale è danneggiato. Un gene vitale che produce una proteina necessaria per una specifica funzione dell'organismo potrebbe essere mutato, modificato dalle radiazioni o colpito da virus.
Quando il gene non funziona correttamente, nella cellula manca una sostanza importante. La terapia genica cerca di sostituire il gene con una versione clonata che produrrà la sostanza richiesta.
La terapia genica è ancora sperimentale e pochi pazienti sono stati curati con questa tecnica. I problemi risiedono nell'identificare il singolo gene responsabile di una condizione medica e nel fornire molte copie del gene alle cellule giuste. Poiché la clonazione del DNA è diventata più diffusa, la terapia genica è stata applicata in diverse situazioni specifiche.
Le recenti applicazioni di successo hanno incluso:
- Morbo di Parkinson: Utilizzando un virus come vettore, un gene correlato al morbo di Parkinson è stato iniettato nel mesencefalo dei pazienti. I pazienti hanno sperimentato migliori capacità motorie senza effetti collaterali negativi.
- Deficit di adenosina deaminasi (ADA): Una malattia immunitaria genetica è stata trattata rimuovendo le cellule staminali del sangue dei pazienti e inserendo il gene ADA. Di conseguenza, i pazienti sono stati in grado di produrre almeno parte del proprio ADA.
- Emofilia: Le persone con emofilia non producono proteine specifiche che aiutano la coagulazione del sangue. Nelle cellule epatiche dei pazienti è stato inserito un gene per la produzione di una delle proteine mancanti. I pazienti hanno prodotto la proteina e gli episodi di sanguinamento sono stati ridotti.
La terapia genica è una delle applicazioni più promettenti della clonazione del DNA, ma è probabile che altri nuovi usi proliferino man mano che vengono studiate più sequenze di DNA e viene determinata la loro funzione. La clonazione del DNA fornisce la materia prima per l'ingegneria genetica nelle quantità necessarie.
Quando il ruolo dei geni è noto e la loro corretta funzione può essere assicurata mediante la sostituzione di quelli difettosi geni, molte malattie croniche e persino il cancro possono essere attaccati e trattati a livello genetico usando il DNA tecnologia.
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